【摘要】：微生物細胞工廠是生產大宗化學品、生物燃料、天然產物的重要技術,其碳源選擇是微生物制造工業(yè)發(fā)展的關鍵問題之一。甲醇基微生物細胞工廠能夠以有機碳一甲醇為原料生產高附加值化合物,是解決糖基細胞工廠“與人爭糧”和技術經濟性的重要途徑,因此研究甲醇基微生物細胞工廠構建及其發(fā)酵工藝具有重要意義。扭脫甲基桿菌AM1是能夠以甲醇為唯一碳源和能源進行生長代謝的甲基模式菌株。本論文以AM1為宿主菌,以通過途徑重構從甲醇合成甲羥戊酸為目標產物,為解決AM1發(fā)酵過程中溶氧不足導致難以實現(xiàn)高密度、影響甲羥戊酸產率的問題,通過在發(fā)酵過程中添加氧載體以及結合基因組途徑工程表達透明顫菌血紅蛋白的手段來解決溶氧限制問題,通過進一步將突變的QscR轉錄調控因子和mvt操縱子整合到pCM110質粒,構建了甲羥戊酸產量提升的工程菌株。進一步通過利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變結合實驗室適應性進化,篩選得到了能夠高耐受甲醇且能夠穩(wěn)定遺傳的高產突變株。通過在搖瓶發(fā)酵過程中添加不同氧載體的策略,提高了扭脫甲基桿菌AM1的生長情況。當在扭脫甲基桿菌AM1發(fā)酵24h后,添加3%的十六烷時,扭脫甲基桿菌AM1的OD_(600)為12.56比不添加組提高19.9%。發(fā)酵120h,沒有添加氧載體的對照組甲羥戊酸終產量143.7mg/L,添加十六烷組的培養(yǎng)體系甲羥戊酸終產量163.7 mg/L,添加十六烷使得甲羥戊酸產量提高了10%左右。通過基因工程在甲基菌AM1中整合vgb基因,也相應的提高了甲基菌AM1的生長能力。在pCM110質粒上表達帶有甲醇脫氫酶啟動子的vgb基因菌株AM1-Δcel/pCM110-P_(maxF)-vgb最高生長OD_(600)達到了19.84,而表達vgb天然啟動子的菌株AM1-Δcel/pCM110-P_(vhb)-vgb最高生長OD_(600)達到了18.73。對照組AM1-dcel::mvt最高生長OD_(600)為10.06。在甲基菌基因組上表達vgb基因的兩株菌AM1-Δcel::(P_(maxF)-vgb)和AM1-Δcel::(P_(vhb)-vgb)生長與對照菌株沒有明顯差別。同時,將QscR轉錄調控因子和mvt操縱子整合到pCM110質粒,在甲基菌AM1中的表達也提高了甲羥戊酸的產量。其在搖瓶中發(fā)酵144h的甲羥戊酸產量為387.65mg/L,是目前搖瓶產甲羥戊酸的最高產量。在5L罐甲醇流加補料中,AM1-Δcel/pCM110-P_(maxF)-vgb-mvt-qscr最高生長OD_(600)達到了38.56,是目前文獻報道最高值,甲羥戊酸產量為1.03g/L。
【圖文】：

2圖 1-1 扭脫甲基桿菌以甲醇為底物的代謝網絡圖譜[10]隨著人們對扭脫甲基桿菌AM1 各方面知識的了解和認識的深入，甲基營養(yǎng)菌的應用前景定會十分開闊。而M.extorquens AM1 作為生產運用的平臺菌株，目前已經成功用于氨基酸、蛋白質、功能化的PHB、1-丁醇、蛇麻烯、甲羥戊酸等

安徽工程大學碩士學位論文多種化學品的生產，涵蓋了生物能源、蛋白質、氨基酸等。本實驗室前期研究者的工作是通過在M.extorquens AM1 中構建甲羥戊酸的代謝途徑，并且運用多種代謝工程的方法組合優(yōu)化了生產甲羥戊酸的菌株，，同時取得了一定的效果。目前，M.extorquens AM1 利用甲醇作為底物來生產高附加值產品的規(guī)模較小且產品遠遠不能達到工業(yè)化規(guī)模的要求。在M.extorquens AM1 的高密度培養(yǎng)工業(yè)化進程中，也只有英國帝國化學工業(yè)集團（ICI）用甲醇作為碳源，實現(xiàn)了單細胞蛋白的這一產品的工業(yè)化生產。我們知道，在M.extorquens AM1 大規(guī)模的高密度培養(yǎng)過程中，發(fā)酵過程中的溶氧和散熱是關鍵性問題，也是限制性問題。能夠解決好這些問題是成功運用M.extorquens AM1 生產高附加值產品的前體保障。
【學位授予單位】：安徽工程大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ921

【參考文獻】

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1 王爽;周巍;劉紅冉;李永波;馬超峰;張巖;;幾種氧載體對納他霉素發(fā)酵的影響[J];食品科學;2015年09期

2 朱艷;袁其朋;王航;;添加氧載體及表面活性劑對番茄紅素發(fā)酵的影響[J];微生物學通報;2006年01期

本文編號：2630148