發(fā)布時(shí)間：2020-04-16 23:17

【摘要】：微生物細(xì)胞工廠是生產(chǎn)大宗化學(xué)品、生物燃料、天然產(chǎn)物的重要技術(shù),其碳源選擇是微生物制造工業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題之一。甲醇基微生物細(xì)胞工廠能夠以有機(jī)碳一甲醇為原料生產(chǎn)高附加值化合物,是解決糖基細(xì)胞工廠“與人爭(zhēng)糧”和技術(shù)經(jīng)濟(jì)性的重要途徑,因此研究甲醇基微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建及其發(fā)酵工藝具有重要意義。扭脫甲基桿菌AM1是能夠以甲醇為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)代謝的甲基模式菌株。本論文以AM1為宿主菌,以通過(guò)途徑重構(gòu)從甲醇合成甲羥戊酸為目標(biāo)產(chǎn)物,為解決AM1發(fā)酵過(guò)程中溶氧不足導(dǎo)致難以實(shí)現(xiàn)高密度、影響甲羥戊酸產(chǎn)率的問(wèn)題,通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加氧載體以及結(jié)合基因組途徑工程表達(dá)透明顫菌血紅蛋白的手段來(lái)解決溶氧限制問(wèn)題,通過(guò)進(jìn)一步將突變的QscR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和mvt操縱子整合到pCM110質(zhì)粒,構(gòu)建了甲羥戊酸產(chǎn)量提升的工程菌株。進(jìn)一步通過(guò)利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變結(jié)合實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化,篩選得到了能夠高耐受甲醇且能夠穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)突變株。通過(guò)在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中添加不同氧載體的策略,提高了扭脫甲基桿菌AM1的生長(zhǎng)情況。當(dāng)在扭脫甲基桿菌AM1發(fā)酵24h后,添加3%的十六烷時(shí),扭脫甲基桿菌AM1的OD_(600)為12.56比不添加組提高19.9%。發(fā)酵120h,沒(méi)有添加氧載體的對(duì)照組甲羥戊酸終產(chǎn)量143.7mg/L,添加十六烷組的培養(yǎng)體系甲羥戊酸終產(chǎn)量163.7 mg/L,添加十六烷使得甲羥戊酸產(chǎn)量提高了10%左右。通過(guò)基因工程在甲基菌AM1中整合vgb基因,也相應(yīng)的提高了甲基菌AM1的生長(zhǎng)能力。在pCM110質(zhì)粒上表達(dá)帶有甲醇脫氫酶啟動(dòng)子的vgb基因菌株AM1-Δcel/pCM110-P_(maxF)-vgb最高生長(zhǎng)OD_(600)達(dá)到了19.84,而表達(dá)vgb天然啟動(dòng)子的菌株AM1-Δcel/pCM110-P_(vhb)-vgb最高生長(zhǎng)OD_(600)達(dá)到了18.73。對(duì)照組AM1-dcel::mvt最高生長(zhǎng)OD_(600)為10.06。在甲基菌基因組上表達(dá)vgb基因的兩株菌AM1-Δcel::(P_(maxF)-vgb)和AM1-Δcel::(P_(vhb)-vgb)生長(zhǎng)與對(duì)照菌株沒(méi)有明顯差別。同時(shí),將QscR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和mvt操縱子整合到pCM110質(zhì)粒,在甲基菌AM1中的表達(dá)也提高了甲羥戊酸的產(chǎn)量。其在搖瓶中發(fā)酵144h的甲羥戊酸產(chǎn)量為387.65mg/L,是目前搖瓶產(chǎn)甲羥戊酸的最高產(chǎn)量。在5L罐甲醇流加補(bǔ)料中,AM1-Δcel/pCM110-P_(maxF)-vgb-mvt-qscr最高生長(zhǎng)OD_(600)達(dá)到了38.56,是目前文獻(xiàn)報(bào)道最高值,甲羥戊酸產(chǎn)量為1.03g/L。
【圖文】：

2圖 1-1 扭脫甲基桿菌以甲醇為底物的代謝網(wǎng)絡(luò)圖譜[10]隨著人們對(duì)扭脫甲基桿菌AM1 各方面知識(shí)的了解和認(rèn)識(shí)的深入，甲基營(yíng)養(yǎng)菌的應(yīng)用前景定會(huì)十分開(kāi)闊。而M.extorquens AM1 作為生產(chǎn)運(yùn)用的平臺(tái)菌株，目前已經(jīng)成功用于氨基酸、蛋白質(zhì)、功能化的PHB、1-丁醇、蛇麻烯、甲羥戊酸等

安徽工程大學(xué)碩士學(xué)位論文多種化學(xué)品的生產(chǎn)，涵蓋了生物能源、蛋白質(zhì)、氨基酸等。本實(shí)驗(yàn)室前期研究者的工作是通過(guò)在M.extorquens AM1 中構(gòu)建甲羥戊酸的代謝途徑，并且運(yùn)用多種代謝工程的方法組合優(yōu)化了生產(chǎn)甲羥戊酸的菌株，，同時(shí)取得了一定的效果。目前，M.extorquens AM1 利用甲醇作為底物來(lái)生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的規(guī)模較小且產(chǎn)品遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到工業(yè)化規(guī)模的要求。在M.extorquens AM1 的高密度培養(yǎng)工業(yè)化進(jìn)程中，也只有英國(guó)帝國(guó)化學(xué)工業(yè)集團(tuán)（ICI）用甲醇作為碳源，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞蛋白的這一產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。我們知道，在M.extorquens AM1 大規(guī)模的高密度培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)酵過(guò)程中的溶氧和散熱是關(guān)鍵性問(wèn)題，也是限制性問(wèn)題。能夠解決好這些問(wèn)題是成功運(yùn)用M.extorquens AM1 生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的前體保障。
【學(xué)位授予單位】：安徽工程大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：TQ921

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王爽;周巍;劉紅冉;李永波;馬超峰;張巖;;幾種氧載體對(duì)納他霉素發(fā)酵的影響[J];食品科學(xué);2015年09期

2 朱艷;袁其朋;王航;;添加氧載體及表面活性劑對(duì)番茄紅素發(fā)酵的影響[J];微生物學(xué)通報(bào);2006年01期

本文編號(hào)：2630148