【摘要】：我國(guó)農(nóng)作物秸稈資源豐富,但由于秸稈中木質(zhì)素的存在,其利用和降解都比較困難,而微生物能夠依靠木質(zhì)素降解酶完全降解秸稈中的木質(zhì)素。本論文旨在篩選出高產(chǎn)木質(zhì)素降解酶菌株,并對(duì)菌株產(chǎn)酶及降解秸稈特性,固態(tài)發(fā)酵條件,漆酶純化及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究與分析,結(jié)果如下:1.分離純化獲得39株真菌菌株,經(jīng)初篩和復(fù)篩篩選出兩株產(chǎn)漆酶和錳過(guò)氧化物酶能力較強(qiáng)的菌株:EM03(滑菇Pholiota nameko)和EM07(杏鮑菇Pleurotus eryngii),作為試驗(yàn)菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。2.對(duì)菌株EM03和EM07進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,試驗(yàn)結(jié)果表明兩株菌產(chǎn)漆酶和錳過(guò)氧化物酶具有周期性,培養(yǎng)12 d后酶活性達(dá)到峰值,其中菌株EM03發(fā)酵基質(zhì)中漆酶和錳過(guò)氧化物酶酶活性最大值分別為37.58 Ug~(-1)substrate和20.78 Ug~(-1)substrate;菌株EM07發(fā)酵基質(zhì)中漆酶和錳過(guò)氧化物酶酶活性最大值分別為36.16 Ug~(-1)substrate,8.97 Ug~(-1)substrate。固態(tài)發(fā)酵60 d后,EM03固態(tài)基質(zhì)失重率達(dá)到49.43%,半纖維素降解率達(dá)到57.75%,纖維素的降解率達(dá)到46.03%,木質(zhì)素降解率達(dá)到74.45%;EM07固態(tài)基質(zhì)失重率達(dá)到17.35%,半纖維素降解率達(dá)到12.95%,纖維素的降解率達(dá)到9.70%,木質(zhì)素降解率達(dá)到51.69%。結(jié)合產(chǎn)酶和降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),EM03具有更高的產(chǎn)酶能力和降解木質(zhì)纖維素的能力,作為試驗(yàn)菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。3.通過(guò)部分因子試驗(yàn)、中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)影響菌株EM03固態(tài)發(fā)酵效果的因素進(jìn)行篩選、分析和優(yōu)化。部分因子試驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液中CuSO_4濃度,固態(tài)基質(zhì)初始含水量,發(fā)酵溫度這三個(gè)因素是影響固態(tài)發(fā)酵效果的關(guān)鍵因素。通過(guò)中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析得到菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶和降解木質(zhì)纖維素的最優(yōu)發(fā)酵條件,優(yōu)化結(jié)果可以為固態(tài)發(fā)酵中關(guān)鍵因素參數(shù)的設(shè)定提供理論依據(jù),從而提高產(chǎn)酶量和降解率,縮短發(fā)酵時(shí)間,降低發(fā)酵成本。4.利用硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析從EM03(pholiota nameko)固態(tài)發(fā)酵浸提液中純化出一種漆酶,命名為L(zhǎng)ac-B。SDS-PAGE顯示單一條帶,為分子量約為50.2 kDa。根據(jù)Lac-B光譜學(xué)特征分析該酶具有III型雙核銅中心,結(jié)合N末端氨基酸序列對(duì)比結(jié)果和光譜學(xué)特征,推測(cè)該酶可能是一種黃色漆酶。Lac-B在70℃時(shí)表現(xiàn)出最強(qiáng)活性,熱穩(wěn)定性高,在50℃以下的溫度中保溫90 min后依然保持初始活性的100%以上。在酸性環(huán)境(pH 3.0-5.0)下對(duì)底物的反應(yīng)活性高,穩(wěn)定性強(qiáng)。對(duì)重金屬有一定的耐受性,低濃度的K~+可以作為提高漆酶活性的弱激活劑。NaN_3和DTT對(duì)酶活性有強(qiáng)烈的抑制作用,螯合劑EDTA的存在下,Lac-B活性會(huì)被輕微抑制。以ABTS為底物,Lac-B的K_m值為0.32μM,V_(max)值為0.53 mM/min,以DMP為底物K_m值為0.43μM,V_(max)值為0.48 mM/min。此外,純化酶能夠在不存在氧化還原介體的情況下降解三苯甲烷類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)和雙偶氮類(lèi)染料。結(jié)果表明Lac-B在處理酸性廢液和染料脫色中具有較好的理論研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。
【圖文】：

初步編號(hào)為：S1-S6；（2）食用菌：通過(guò)分離純化獲得 8 種食用菌純培養(yǎng)菌絲體，初步編號(hào)為：EM01（茶樹(shù)菇 Agrocybe aegirit），EM02（雙孢菇 Agaricus bisporus），EM03（滑菇 pholiota nameko），EM04（海鮮菇 Hypsizygus marmoreus），EM05（平菇 Pleurotus ostreatus），EM06（香菇 Lentinus edodes），EM07（杏鮑菇 Pleurotus eryngii Quel.），EM08（楊樹(shù)菇Agrocybe aegerita(Brig.ex Fr.) Sing）；（3）野生擔(dān)子菌：通過(guò)分離純化獲得 17 株野生擔(dān)子菌純培養(yǎng)菌絲體，初步編號(hào)：WB01-WB17；（4）實(shí)驗(yàn)室菌株：對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的 8 株擔(dān)子菌菌株進(jìn)行活化，，初步編號(hào)：LF01-LF08。2.2.2 菌株的初篩培養(yǎng)一段時(shí)間后，愈創(chuàng)木酚平板顯色反應(yīng)、苯胺藍(lán)平板褪色反應(yīng)和氯化錳平板顯色反應(yīng)結(jié)果如圖 2.1 所示，以顯色圈和褪色圈出現(xiàn)需要時(shí)間的長(zhǎng)短以及顯色圈和褪色圈直徑的大小和顏色深淺作為依據(jù)進(jìn)行的篩選。a b c

圖 2.2 菌株 WB04 形態(tài)特征圖（a，子實(shí)體；b，菌落；c，菌絲 40×10）Fig.2.2 Morphological characteristics of strain WB04（a, sporocarp; b, colony; c, hypha 40×10）2.2.4.2 分子生物學(xué)鑒定圖 2.3 為菌株 WB04 ITS 區(qū) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，單一條帶，與 Marker 電泳條帶對(duì)比，單一條帶位于 750 bp 左右，與目標(biāo)條帶大小一致，表明菌株 ITS 區(qū)擴(kuò)增正確，可以用于測(cè)序。圖 2.3 菌株 WB04 ITS 區(qū) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q936;TQ925

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉為光;竇其全;曹宗軍;朱慶春;;不同培養(yǎng)料配方對(duì)滑子菇產(chǎn)量及效益的影響試驗(yàn)[J];農(nóng)業(yè)與技術(shù);2015年15期

2 臧玉紅;李仁杰;;響應(yīng)面法對(duì)滑子菇多糖提取工藝的優(yōu)化[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年22期

3 杜靜;陳廣銀;黃紅英;靳紅梅;奚永蘭;錢(qián)玉婷;徐躍定;常志州;;秸稈批式和半連續(xù)式發(fā)酵物料濃度對(duì)沼氣產(chǎn)率的影響[J];農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào);2015年15期

4 潘根興;李戀卿;劉曉雨;程琨;卞榮軍;吉春穎;鄭聚峰;張旭輝;鄭金偉;;熱裂解生物質(zhì)炭產(chǎn)業(yè)化:秸稈禁燒與綠色農(nóng)業(yè)新途徑[J];科技導(dǎo)報(bào);2015年13期

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本文編號(hào)：2623760