發(fā)布時間：2020-04-10 02:58

【摘要】：巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成功的真核表達(dá)系統(tǒng)之一,與其它表達(dá)系統(tǒng)相比在產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的加工、外分泌、翻譯后修飾等方面有明顯的優(yōu)勢。工業(yè)生產(chǎn)中可將畢赤酵母發(fā)酵過分為菌體生長和甲醇誘導(dǎo)兩個階段。一般的,在菌體主要使用甘油作為碳源,在誘導(dǎo)階段主要依靠溶氧數(shù)值,結(jié)合生產(chǎn)經(jīng)驗來進(jìn)行誘導(dǎo)調(diào)控。針對甘油成本高、粘度大等缺陷,本論文首先考察了采用葡萄糖替代甘油作為碳源進(jìn)行菌體擴(kuò)增的可行性,然后引入生物傳感器進(jìn)行甲醇濃度檢測,在溶氧電極基礎(chǔ)上,建立了更為精準(zhǔn)的誘導(dǎo)調(diào)控策略。主要取得了如下研究成果:一.考察了葡萄糖代替甘油進(jìn)行畢赤酵母發(fā)酵的可行性,搖瓶和10L發(fā)酵罐結(jié)果表明,以甘油和葡萄糖作為碳源進(jìn)行畢赤酵母發(fā)酵時,菌體的生長過程是同步的,因此,葡萄糖代替甘油進(jìn)行畢赤酵母發(fā)酵是可行的。(1)搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明,只要可以將初始碳源的殘留處理完全,目標(biāo)蛋白的表達(dá)與生長階段的碳源種類關(guān)系不大,葡萄糖和甘油均可。(2)10L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果表明,通過優(yōu)化葡萄糖的補料策略,可以達(dá)到與甘油為碳源進(jìn)行發(fā)酵時的菌體細(xì)胞生長速率,在降低原料成本的同時,沒有延長發(fā)酵周期。(3)以畢赤酵母表達(dá)葡萄糖氧化酶和脂肪酶為例,采用葡萄糖為唯一碳源進(jìn)行菌體細(xì)胞擴(kuò)增時,經(jīng)過約48 h的培養(yǎng),菌體細(xì)胞濕重均可達(dá)到180~220 g/L。二.發(fā)酵過程調(diào)控方面,采用生物傳感器進(jìn)行葡萄糖和甲醇的快速檢測,降低了葡萄糖的阻遏效應(yīng),避免了因甲醇用量不當(dāng)導(dǎo)致的細(xì)胞中毒情況,建立了更為精準(zhǔn)的調(diào)控策略。(1)采用生物傳感儀密切監(jiān)控葡萄糖和甲醇的濃度,實現(xiàn)了菌體生長和誘導(dǎo)階段的精準(zhǔn)調(diào)控,避免了由于溶氧電極標(biāo)定和使用誤差導(dǎo)致的負(fù)面影響。(2)優(yōu)化了甲醇誘導(dǎo)策略,通過針對性的縮短“饑餓時間”或者直接誘導(dǎo),或者提前添加甲醇等方式,實現(xiàn)了外源蛋白的高效表達(dá)。(3)以畢赤酵母表達(dá)葡萄糖氧化酶和脂肪酶為例,發(fā)酵周期為82-90h,活性分別為:葡萄糖氧化酶27.3 U/L、32.9 U/L,脂肪酶5300 U/L、5175 U/L,使用葡萄糖作為碳源發(fā)酵以達(dá)到與使用甘油基本一致的水平。
【圖文】：

碳源進(jìn)行培養(yǎng)，通常在培養(yǎng)約 16-24h后畢赤酵母耗盡發(fā)酵基礎(chǔ)培4%的甘油，期間通過對通氣和攪拌轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)維持溶氧水平在 30%增加[35]。批流加的過渡階段。在甘油流加階段（Glycerol fed-batchphase）加基礎(chǔ)碳源即甘油，來使得菌體細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增。在菌體擴(kuò)增階段甘油其耗盡時溶氧值會驟升至 100%左右，這時開始補充流加 50%控制甘油流加速率、通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，維持溶氧水平在 30%左導(dǎo)階段。在甲醇流加誘導(dǎo)階段（Methanol fed-batchphase）停止流基中的甘油完全消耗后，即溶氧數(shù)值升至 100%時，開始甲醇的流1 啟動子表達(dá)驅(qū)動外源基因表達(dá)。此階段中，調(diào)整甲醇補加速率， 20%左右，使菌體慢慢適應(yīng)利用甲醇進(jìn)行生長并表達(dá)目標(biāo)外源蛋白的蛋白和菌株的不同，此階段控制最終甲醇流加的速率和流加持續(xù)不同[37]。

4圖 1.2 畢氏酵母甘油代謝途徑[39]Fig. 1.2 Metabolic pathway of glycerol in Pichia pastoris甘油在細(xì)胞內(nèi)，首先被甘油激酶磷酸化為三磷酸甘油 G3P（Glycerolosphate）。G3P 在三磷酸甘油脫氫酶的作用下被氧化為磷酸二羥丙酮。經(jīng)解過程，磷酸二羥丙酮被分解成丙酮酸（PYR）[40]。丙酮酸在丙酮酸脫氫用下被氧化為乙酰輔 A（Acetyl-CoA）。乙酰輔酶 A 直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)Acycle），在此過程中會有大量細(xì)胞物質(zhì)合成，同時伴隨電子載體（NADH量的轉(zhuǎn)換。在代謝過程中，如果溶氧或者丙酮酸脫羧反應(yīng)速率受到限制，會進(jìn)入乙醇發(fā)酵途徑[41]。此時，，丙酮酸在丙酮酸脫羧酶的作用下生成乙醛在醇脫氫酶的作用下生成乙醇。而當(dāng)上述限制解除后，乙醇又可作為基質(zhì)，這時，乙醇首先被氧化為乙醛，乙醛進(jìn)而被氧化為乙酸鹽，最后轉(zhuǎn)化為
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ920.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2621652