甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)是典型的二型態(tài)真菌,由其引起的甘蔗黑穗病是一個(gè)全球性的病害,對(duì)甘蔗產(chǎn)量和含糖量造成巨大損失。RNA干擾是一種保守的小RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。目前甘蔗黑穗病菌的RNA干擾系統(tǒng)尚未明確。本研究用蛋白保守結(jié)構(gòu)域?qū)Ω收岷谒氩【蚪M進(jìn)行搜索,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)RNA干擾組件DICER-LIKE (SsDcl)蛋白。序列分析顯示此蛋白具有剪切雙鏈RNA所必需的RNaseⅢ結(jié)構(gòu)域和雙鏈RNA識(shí)別區(qū)域。為了研究ssdcl基因的功能,本研究以甘蔗黑穗病菌單倍體JG36為出發(fā)菌株,構(gòu)建了ssdcl基因的缺失突變株。與野生型相比,Δssdcl突變體的生長(zhǎng)速度較慢,與野生型JG35配合后形成的二倍體菌絲更為細(xì)小,且分支較多,表明ssdcl基因的缺失可能影響了黑穗病菌菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。另外,Northern blot和qRT-PCR的結(jié)果顯示,ssdcl基因缺失突變體中milR-4的表達(dá)量下調(diào),提示ssdcl基因在甘蔗黑穗病菌milRNAs形成過(guò)程中起重要作用。

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圖1 Ss Dcl蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析和進(jìn)化樹(shù)分析

以甘蔗黑穗病菌單倍體菌株JG36的基因組DNA為模板，分別用引物對(duì)DicerL-P1/DicerL-P2和DicerR-P1/DicerR-P2擴(kuò)增ssdcl基因起始密碼子上游1721bp同源片段及終止密碼子下游1840bp同源片段。將左臂同源片段與pEX2分別經(jīng)PmeⅠ....

圖2 重組質(zhì)粒pEX2-L和pEX2-L-R的驗(yàn)證

為了揭示ssdcl基因是否參與milRNA的形成，本研究在實(shí)驗(yàn)室已有的黑穗病菌的smallRNA測(cè)序結(jié)果中(未發(fā)表)，挑選了一個(gè)經(jīng)過(guò)表達(dá)驗(yàn)證的milR-NA(milR-4)，分析其在ssdcl突變體中表達(dá)量的變化。Northernblot及qRT-PCR的結(jié)果均顯示，相對(duì)于野....

圖3 ssdcl基因缺失突變體的PCR驗(yàn)證和Southern blot驗(yàn)證

以往的研究表明，綠僵菌(Metarhiziumrobertsii)的dcl基因敲除后，突變株的分生孢子產(chǎn)量和致病能力有所降低(Mengetal.,2017)；禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中敲除dcl-1基因后導(dǎo)致子囊孢子的產(chǎn)量降低，同時(shí)敲除dcl-....

圖4 ssdcl基因缺失突變株表型和菌絲顯微觀察

圖3ssdcl基因缺失突變體的PCR驗(yàn)證和Southernblot驗(yàn)證目前還沒(méi)有關(guān)于甘蔗黑穗病菌RNA干擾相關(guān)的研究，本實(shí)驗(yàn)室在甘蔗黑穗病菌中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)RNA干擾相關(guān)的組件，Dicer-like(SPSC＿00615)、Argonaute(SPSC＿04765)、3個(gè)RDRP....

本文編號(hào)：4039176