發(fā)布時間：2020-11-21 13:12

　　 芝麻莖點枯病是由菜豆殼球孢(Macrophomina phaseolina)引起的真菌性土傳病害,對芝麻的產(chǎn)量和質(zhì)量造成了嚴重威脅。因此,挖掘抗病基因,選育和種植抗病品種,對保證芝麻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有十分重要的意義。本研究用不同地區(qū)的44個芝麻品種進行田間芝麻莖點枯病的抗性鑒定。借助轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果挑選出兩個抗芝麻莖點枯病相關(guān)基因SiPYL4、SiTLP,對SiPYL4、SiTLP進行了克隆,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了植物過表達載體,對擬南芥進行遺傳轉(zhuǎn)化,并對轉(zhuǎn)基因植株進行了抗病性鑒定,主要得到以下結(jié)果:1、對不同地區(qū)的44個芝麻品種進行了田間芝麻對莖點枯病的抗性鑒定,鑒定結(jié)果表明,沒有高抗和免疫品種,中抗(MR)芝麻種質(zhì)資源為26份,占供試種質(zhì)的59.1%;中感(MS)芝麻種質(zhì)資源共14份,占供試種質(zhì)的31.82%;高感(HS)芝麻種質(zhì)資源2份,占供試種質(zhì)4.55%。2、利用同源克隆技術(shù)克隆出SiPYL4、SiTLP基因。SiPYL4全長645bp,編碼215個氨基酸,SiTLP全長681bp,編碼227個氨基酸。3、對抗感芝麻品種進行菜豆殼球孢脅迫處理后,進行熒光定量分析,結(jié)果SiPYL4在抗病品種鄭芝13中出現(xiàn)上調(diào)表達,在36 h時表達量較高,在感病品種冀9014中72h也出現(xiàn)了上調(diào)表達。SiTLP基因在抗、感品種中脅迫處理12h時同時出現(xiàn)表達量明顯上升的情況,在感病品種冀9014中24h時表達量出現(xiàn)最高峰。隨著脅迫時間的延長SOD、POD、CAT、H_2O_2含量也隨之增加。4、超表達SiPYL4、SiTLP的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型相比有著較高的生長活性。菜豆殼球孢脅迫7天后野生型擬南芥感病癥狀明顯,嚴重的整株枯死,轉(zhuǎn)基因擬南芥只有底部蓮座葉片有輕微枯黃。轉(zhuǎn)基因擬南芥的活性氧清除能力也明顯強于野生型擬南芥,因此推測SiPYL4、SiTLP基因在擬南芥抗菜豆殼球孢侵染過程中起關(guān)鍵作用。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S435.653
【部分圖文】：

圖 1.3 菜豆殼球孢菌（A：菜豆殼球孢在 PDA 培養(yǎng)基上的形態(tài)；B：菜豆殼球孢菌核；C：菜豆殼球孢分生孢子器和分生孢子）Fig 1.3 (A: Macrophomina phaseolina morphology on PDA medium;B: Sclerotia ofMacrophomina phaseolina;C: Conidia and conidium of Macrophomina phaseolina)1.3.2 發(fā)病時期與癥狀在芝麻幼苗期，菜豆殼球孢最先侵染子葉時期的芝麻，特別是雨后天氣放晴達到侵染的最佳時期，病苗根部會受到嚴重侵害直至死亡。在芝麻枯死后芝麻莖稈上會產(chǎn)生許多小黑點，這些小黑點就是菜豆殼球孢的分生孢子器和菌核。在芝麻成株期時，莖點枯病主要集中在芝麻開花及結(jié)蒴果時期。病原菌首先侵染芝麻的根部然后從根部往莖部逐漸蔓延，根部受侵害部位首先腐爛枯死，黑色的菌核布滿芝麻的皮層，待病原菌蔓延至地表以上芝麻莖基部時，初期發(fā)病部位呈淺褐色，隨著發(fā)病面積的擴大顏色逐漸加深，發(fā)病后期病斑顏色變?yōu)楹诤稚o稈表面上密布黑色的菜豆殼球孢的分生孢子器。由于黑色小菌核侵入芝麻皮層內(nèi)，導致芝麻莖稈組織受到嚴重壞死。發(fā)病嚴重的芝麻植株，從莖基部至芝麻頂部甚至全株葉片都會枯萎卷縮[33]。

根據(jù)本實驗室前期豫芝 11 與 Mp2010028C 苗期互作的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，拼接的 SiPYL4 和 SiTLP 序列，在芝麻基因組數(shù)據(jù)庫中進行 Blast 比對得到一致性為百分之百的序列，在 NCBI 中的編號分別為 SiPYL4：LOC105167014，SiTLP ： LOC105157575 。其中 SiPYL4-like(Sesamum indicum abscisic acidreceptor)注釋為芝麻脫落酸受體 PYL4 類似蛋白，全長 972bp,位于芝麻 7 號染色體（LG7:10587814:10588455:- ），SiTLP（Sesamum indicum thaumatin-likeprotein ） 注釋為芝麻類甜蛋白基因，全長 920bp, 位于芝麻 1 號染色體（LG1:6869724:6870404:+）。以鄭芝 13 芝麻葉片 cDNA 為模板，分別以引物SiPYL4-F/R、SiTLP-F/R 克隆 SiPYL4、SiTLP 基因的 cDNA 全長片段；以引物SiPYL4-F/R、SiTLP-F/R 克隆 SiPYL4-like、SiTLP 基因的 DNA 基因組全長，擴增結(jié)果顯示 SiPYL4、SiTLP 基因的 cDNA 全長和 DNA 基因組全長片段大小相等，PCR 擴增結(jié)果如圖 3.1A 和 B。其中 SiPYL4 基因片段為 645bp、SiTLP基因片段大小為 681bp。又分別在抗莖點枯病芝麻品種：鄭芝 13、新蔡選抗、商水農(nóng)家種、豫芝 4 號、豫芝 11，感病品種：冀 9014、Fy1201、Fy1202、晉芝 3 號中進行 SiPYL4、SiTLP 基因的擴增，結(jié)果如圖 3.2A和 B。

3 芝麻 SiPYL4、SiTLP 基因的分子克隆與鑒定為 SiTLP 基因）B:（M 為 DL2000bp DNA ladder marker、1~2 泳SiPYL4 基因，3~4 泳道為 SiTLP 基因）。.1 A: Full-length cDNA fragment of SiPYL4 and SiTLP genes;B: Full-length clonSiPYL4 and SiTLP gene DNA genome): A (M is DL2000bp DNA ladder marker, lane 1~2 is SiPYL4 gene, lane 3~4 is Si is DL2000bp DNA ladder marker, lane 1~2 is SiPYL4 gene, lane 3~4 is SiTLP
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本文編號：2893050