美國(guó)白蛾Hyphantria cunea(Drury)屬鱗翅目(Lepidoptera)燈蛾科(Arctiidae)昆蟲,是一種重要的世界性檢疫害蟲,也是我國(guó)重大入侵害蟲之一。由于其寄主范圍廣、繁殖能力強(qiáng)和傳播速度快等特點(diǎn),對(duì)我國(guó)森林資源、農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)建設(shè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。據(jù)國(guó)家林業(yè)局2018年第3、4號(hào)公告顯示,我國(guó)美國(guó)白蛾疫區(qū)已涉及全國(guó)11個(gè)省(區(qū)、市)的572個(gè)縣級(jí)行政區(qū)。蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前研究最成熟、應(yīng)用最廣泛的殺蟲微生物,具有特異性強(qiáng)、環(huán)境友好和使用便捷等諸多優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成功用于多種重要農(nóng)林業(yè)害蟲的防治,但用于美國(guó)白蛾防治的報(bào)道卻相對(duì)較少。本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的15株Bt野生菌株進(jìn)行生物活性測(cè)定,篩選出5株對(duì)美國(guó)白蛾具有高效殺蟲活性的Bt菌株,分別為G31、GS24、GS31、GS36和GS70。該5株Bt菌株對(duì)美國(guó)白蛾一齡3 d幼蟲的LC₅₀(50%Lethal concentration)值為0.084⁰.268 mg/mL胞晶混合物,其中GS36菌株殺蟲活性最高,LC

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 美國(guó)白蛾簡(jiǎn)介
        1.1.1 美國(guó)白蛾發(fā)生與為害狀況
        1.1.2 美國(guó)白蛾防治現(xiàn)狀
    1.2 蘇云金桿菌及殺蟲蛋白概述
        1.2.1 蘇云金桿菌Bt概況
        1.2.2 Bt殺蟲蛋白種類
        1.2.3 Bt殺蟲晶體蛋白的進(jìn)化
        1.2.4 Bt殺蟲晶體蛋白的結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.5 Bt殺蟲晶體蛋白作用機(jī)制
        1.2.6 Bt殺蟲蛋白增效途徑
    1.3 Bt殺蟲蛋白在昆蟲中腸受體
        1.3.1 氨肽酶N(AminopeptidaseN,APN)
        1.3.2 鈣粘蛋白(Cadherin,CAD)
        1.3.3 堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)
        1.3.4 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-binding cassette transporter,ABC)
        1.3.5 其它受體蛋白
    1.4 本研究的目的和意義
2 對(duì)美國(guó)白蛾高效活性Bt菌株的篩選
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 供試?yán)ハx
        2.1.2 供試菌株
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 主要溶液及試劑
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 Bt菌株對(duì)美國(guó)白蛾殺蟲活性測(cè)定
        2.2.2 Bt菌株晶體形態(tài)觀察
        2.2.3 Bt菌株cry基因型鑒定
        2.2.4 Bt菌株晶體蛋白SDS-PAGE分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 Bt菌株對(duì)美國(guó)白蛾殺蟲活性測(cè)定
        2.3.2 Bt菌株晶體形態(tài)觀察
        2.3.3 Bt菌株cry基因型鑒定
        2.3.4 Bt菌株晶體蛋白SDS-PAGE分析
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
3 對(duì)美國(guó)白蛾高效Cry1Ab35蛋白的表達(dá)及活性分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 供試?yán)ハx
        3.1.2 菌株及質(zhì)粒
        3.1.3 培養(yǎng)基
        3.1.4 主要溶液及試劑
        3.1.5 主要儀器設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 Bt菌株質(zhì)粒的提取
        3.2.2 cry1Ab35基因的克隆與原核表達(dá)
        3.2.3 Bt工程菌HD1Ab35的構(gòu)建
        3.2.4 Bt工程菌HD1Ab35晶體蛋白提取
        3.2.5 Cry1Ab35蛋白濃度的測(cè)定
        3.2.6 Cry1Ab35蛋白抗體的制備
        3.2.7 Cry1Ab35蛋白殺蟲活性測(cè)定
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 cry1Ab35基因的克隆與序列分析
        3.3.2 cry1Ab35基因的原核表達(dá)
        3.3.3 工程菌HD1Ab35的構(gòu)建及鑒定
        3.3.4 工程菌HD1Ab35晶體蛋白形態(tài)觀察
        3.3.5 工程菌HD1Ab35晶體蛋白的表達(dá)及定量
        3.3.6 Cry1Ab35蛋白殺蟲活性測(cè)定
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 Cry1Ab35蛋白對(duì)美國(guó)白蛾殺蟲活性增效因子
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 供試?yán)ハx
        4.1.2 菌株及質(zhì)粒
        4.1.3 昆蟲病毒
        4.1.4 主要溶液及試劑
        4.1.5 主要儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 TnGV的增殖、提取與純化
        4.2.2 TnGV Enhancin蛋白的制備
        4.2.3 Bt GS36菌株enhancin-like基因的克隆
        4.2.4 Enhancin-like蛋白的原核表達(dá)
        4.2.5 Enhancin-like蛋白的提取與純化
        4.2.6 三種增效因子在Cry1Ab35蛋白對(duì)美國(guó)白蛾殺蟲活性中的增效作用分析
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 TnGV Enhancin蛋白的檢測(cè)
        4.3.2 enhancin-like基因的克隆及序列分析
        4.3.3 enhancin-like基因的原核表達(dá)
        4.3.5 三種增效因子在Cry1Ab35蛋白對(duì)美國(guó)白蛾殺蟲活性中的增效作用
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 美國(guó)白蛾中腸Cry1Ab35蛋白結(jié)合蛋白的鑒定
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 供試?yán)ハx
        5.1.2 菌株及質(zhì)粒
        5.1.3 主要溶液及試劑
        5.1.4 主要儀器設(shè)備
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 Cry1Ab35蛋白的活化
        5.2.2 美國(guó)白蛾中腸BBMV蛋白的提取
        5.2.3 Ligandblot檢測(cè)Cry1Ab35蛋白結(jié)合蛋白
        5.2.4 Cry1Ab35蛋白結(jié)合蛋白LC-MS/MS分析
        5.2.5 美國(guó)白蛾幼蟲及組織樣本制備
        5.2.6 美國(guó)白蛾總RNA的提取及cDNA合成
        5.2.7 hcapns基因的克隆與序列分析
        5.2.8 hcapns基因時(shí)空表達(dá)分析
        5.2.9 飼喂美國(guó)白蛾幼蟲Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表達(dá)分析
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 Cry1Ab35蛋白的活化
        5.3.2 美國(guó)白蛾中腸BBMV蛋白的檢測(cè)
        5.3.3 Cry1Ab35蛋白美國(guó)白蛾中腸BBMV結(jié)合蛋白的鑒定
        5.3.4 美國(guó)白蛾中腸Cry1Ab35蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析
        5.3.5 hcapns基因的克隆
        5.3.6 hcapns基因序列分析
        5.3.7 hcapns基因時(shí)空表達(dá)分析
        5.3.8 飼喂美國(guó)白蛾幼蟲Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表達(dá)水平分析
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
6 美國(guó)白蛾HcAPNs蛋白的表達(dá)及功能分析
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
        6.1.1 供試?yán)ハx
        6.1.2 菌株及質(zhì)粒
        6.1.3 培養(yǎng)基及試劑
        6.1.4 主要儀器設(shè)備
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 重組HcAPNs蛋白在昆蟲細(xì)胞系Sf9中的表達(dá)
        6.2.2 重組HcAPNs蛋白與Cry1Ab35蛋白結(jié)合分析
        6.2.3 hcapns基因RNAi及功能分析
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 重組Bacmid-hcapns的構(gòu)建
        6.3.2 重組HcAPNs蛋白在昆蟲細(xì)胞系Sf9中的表達(dá)
        6.3.3 重組HcAPNs蛋白與Cry1Ab35蛋白結(jié)合分析
        6.3.4 dsRNA的合成及檢測(cè)
        6.3.5 注射美國(guó)白蛾幼蟲dsRNA-hcapns后hcapns基因表達(dá)水平檢測(cè)
        6.3.6 注射dsRNA-hcapns美國(guó)白蛾幼蟲對(duì)Cry1Ab35蛋白敏感性測(cè)定
    6.4 討論
    6.5 小結(jié)
全文結(jié)論
本研究創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
在讀期間已發(fā)表論文
作者簡(jiǎn)歷
致謝



本文編號(hào)：3876539