美國白蛾Hyphantria cunea(Drury)屬鱗翅目(Lepidoptera)燈蛾科(Arctiidae)昆蟲,是一種重要的世界性檢疫害蟲,也是我國重大入侵害蟲之一。由于其寄主范圍廣、繁殖能力強和傳播速度快等特點,對我國森林資源、農林業(yè)生產和生態(tài)建設造成了嚴重損失。據(jù)國家林業(yè)局2018年第3、4號公告顯示,我國美國白蛾疫區(qū)已涉及全國11個省(區(qū)、市)的572個縣級行政區(qū)。蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前研究最成熟、應用最廣泛的殺蟲微生物,具有特異性強、環(huán)境友好和使用便捷等諸多優(yōu)點,已經成功用于多種重要農林業(yè)害蟲的防治,但用于美國白蛾防治的報道卻相對較少。本研究對本實驗室保存的15株Bt野生菌株進行生物活性測定,篩選出5株對美國白蛾具有高效殺蟲活性的Bt菌株,分別為G31、GS24、GS31、GS36和GS70。該5株Bt菌株對美國白蛾一齡3 d幼蟲的LC₅₀(50%Lethal concentration)值為0.084⁰.268 mg/mL胞晶混合物,其中GS36菌株殺蟲活性最高,LC

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 美國白蛾簡介
        1.1.1 美國白蛾發(fā)生與為害狀況
        1.1.2 美國白蛾防治現(xiàn)狀
    1.2 蘇云金桿菌及殺蟲蛋白概述
        1.2.1 蘇云金桿菌Bt概況
        1.2.2 Bt殺蟲蛋白種類
        1.2.3 Bt殺蟲晶體蛋白的進化
        1.2.4 Bt殺蟲晶體蛋白的結構與功能
        1.2.5 Bt殺蟲晶體蛋白作用機制
        1.2.6 Bt殺蟲蛋白增效途徑
    1.3 Bt殺蟲蛋白在昆蟲中腸受體
        1.3.1 氨肽酶N(AminopeptidaseN,APN)
        1.3.2 鈣粘蛋白(Cadherin,CAD)
        1.3.3 堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)
        1.3.4 ABC轉運體(ATP-binding cassette transporter,ABC)
        1.3.5 其它受體蛋白
    1.4 本研究的目的和意義
2 對美國白蛾高效活性Bt菌株的篩選
    2.1 實驗材料
        2.1.1 供試昆蟲
        2.1.2 供試菌株
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 主要溶液及試劑
        2.1.5 主要儀器設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 Bt菌株對美國白蛾殺蟲活性測定
        2.2.2 Bt菌株晶體形態(tài)觀察
        2.2.3 Bt菌株cry基因型鑒定
        2.2.4 Bt菌株晶體蛋白SDS-PAGE分析
    2.3 結果與分析
        2.3.1 Bt菌株對美國白蛾殺蟲活性測定
        2.3.2 Bt菌株晶體形態(tài)觀察
        2.3.3 Bt菌株cry基因型鑒定
        2.3.4 Bt菌株晶體蛋白SDS-PAGE分析
    2.4 討論
    2.5 小結
3 對美國白蛾高效Cry1Ab35蛋白的表達及活性分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 供試昆蟲
        3.1.2 菌株及質粒
        3.1.3 培養(yǎng)基
        3.1.4 主要溶液及試劑
        3.1.5 主要儀器設備
    3.2 實驗方法
        3.2.1 Bt菌株質粒的提取
        3.2.2 cry1Ab35基因的克隆與原核表達
        3.2.3 Bt工程菌HD1Ab35的構建
        3.2.4 Bt工程菌HD1Ab35晶體蛋白提取
        3.2.5 Cry1Ab35蛋白濃度的測定
        3.2.6 Cry1Ab35蛋白抗體的制備
        3.2.7 Cry1Ab35蛋白殺蟲活性測定
    3.3 結果與分析
        3.3.1 cry1Ab35基因的克隆與序列分析
        3.3.2 cry1Ab35基因的原核表達
        3.3.3 工程菌HD1Ab35的構建及鑒定
        3.3.4 工程菌HD1Ab35晶體蛋白形態(tài)觀察
        3.3.5 工程菌HD1Ab35晶體蛋白的表達及定量
        3.3.6 Cry1Ab35蛋白殺蟲活性測定
    3.4 討論
    3.5 小結
4 Cry1Ab35蛋白對美國白蛾殺蟲活性增效因子
    4.1 實驗材料
        4.1.1 供試昆蟲
        4.1.2 菌株及質粒
        4.1.3 昆蟲病毒
        4.1.4 主要溶液及試劑
        4.1.5 主要儀器設備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 TnGV的增殖、提取與純化
        4.2.2 TnGV Enhancin蛋白的制備
        4.2.3 Bt GS36菌株enhancin-like基因的克隆
        4.2.4 Enhancin-like蛋白的原核表達
        4.2.5 Enhancin-like蛋白的提取與純化
        4.2.6 三種增效因子在Cry1Ab35蛋白對美國白蛾殺蟲活性中的增效作用分析
    4.3 結果與分析
        4.3.1 TnGV Enhancin蛋白的檢測
        4.3.2 enhancin-like基因的克隆及序列分析
        4.3.3 enhancin-like基因的原核表達
        4.3.5 三種增效因子在Cry1Ab35蛋白對美國白蛾殺蟲活性中的增效作用
    4.4 討論
    4.5 小結
5 美國白蛾中腸Cry1Ab35蛋白結合蛋白的鑒定
    5.1 實驗材料
        5.1.1 供試昆蟲
        5.1.2 菌株及質粒
        5.1.3 主要溶液及試劑
        5.1.4 主要儀器設備
    5.2 實驗方法
        5.2.1 Cry1Ab35蛋白的活化
        5.2.2 美國白蛾中腸BBMV蛋白的提取
        5.2.3 Ligandblot檢測Cry1Ab35蛋白結合蛋白
        5.2.4 Cry1Ab35蛋白結合蛋白LC-MS/MS分析
        5.2.5 美國白蛾幼蟲及組織樣本制備
        5.2.6 美國白蛾總RNA的提取及cDNA合成
        5.2.7 hcapns基因的克隆與序列分析
        5.2.8 hcapns基因時空表達分析
        5.2.9 飼喂美國白蛾幼蟲Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表達分析
    5.3 結果與分析
        5.3.1 Cry1Ab35蛋白的活化
        5.3.2 美國白蛾中腸BBMV蛋白的檢測
        5.3.3 Cry1Ab35蛋白美國白蛾中腸BBMV結合蛋白的鑒定
        5.3.4 美國白蛾中腸Cry1Ab35蛋白結合蛋白質譜分析
        5.3.5 hcapns基因的克隆
        5.3.6 hcapns基因序列分析
        5.3.7 hcapns基因時空表達分析
        5.3.8 飼喂美國白蛾幼蟲Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表達水平分析
    5.4 討論
    5.5 小結
6 美國白蛾HcAPNs蛋白的表達及功能分析
    6.1 實驗材料
        6.1.1 供試昆蟲
        6.1.2 菌株及質粒
        6.1.3 培養(yǎng)基及試劑
        6.1.4 主要儀器設備
    6.2 實驗方法
        6.2.1 重組HcAPNs蛋白在昆蟲細胞系Sf9中的表達
        6.2.2 重組HcAPNs蛋白與Cry1Ab35蛋白結合分析
        6.2.3 hcapns基因RNAi及功能分析
    6.3 結果與分析
        6.3.1 重組Bacmid-hcapns的構建
        6.3.2 重組HcAPNs蛋白在昆蟲細胞系Sf9中的表達
        6.3.3 重組HcAPNs蛋白與Cry1Ab35蛋白結合分析
        6.3.4 dsRNA的合成及檢測
        6.3.5 注射美國白蛾幼蟲dsRNA-hcapns后hcapns基因表達水平檢測
        6.3.6 注射dsRNA-hcapns美國白蛾幼蟲對Cry1Ab35蛋白敏感性測定
    6.4 討論
    6.5 小結
全文結論
本研究創(chuàng)新點
參考文獻
在讀期間已發(fā)表論文
作者簡歷
致謝



本文編號：3876539