蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一種革蘭氏陽性菌,其在芽胞形成階段產(chǎn)生的Cry毒素是一種對多種農(nóng)林害蟲具有特異殺蟲活性的蛋白毒素。Cry毒素對非靶標生物無毒性,其制劑被廣泛應用于農(nóng)林害蟲防治以及抗蟲轉(zhuǎn)基因作物改造。隨著Cry制劑的大量使用,部分田間害蟲已對Cry毒素產(chǎn)生抗性,抗性的產(chǎn)生嚴重妨害了Cry相關(guān)制劑的后續(xù)應用。因此,深入研究Cry殺蟲作用時的分子過程,揭開Cry殺蟲機理的全貌,是從根本上解決Bt發(fā)展問題的理論基礎(chǔ)。目前公認的Cry作用機制模型主要有二種:穿孔模型和信號轉(zhuǎn)導模型。Cry毒素與昆蟲中腸刷狀緣膜微囊(BBMVs)上受體的結(jié)合是Cry毒素發(fā)揮殺蟲功能的關(guān)鍵步驟。至今有報道的BBMVs受體包括堿性磷酸酶(ALP)、氨肽酶N(APN)、鈣黏蛋白(CAD)、ABCC2轉(zhuǎn)運蛋白以及最新發(fā)現(xiàn)的V-ATPase亞基B。然而,昆蟲中腸腸腔液中是否存在能夠與Cry毒素結(jié)合的可溶性蛋白,以及其可能存在的對Cry殺蟲過程的影響,還未有報道。因此本研究從昆蟲中腸腸腔液中可溶性Cry毒素非受體結(jié)合蛋白的新角度,研究Cry毒素殺蟲的分子過程。本研究克隆表達...

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【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
第1章 前言
    1.1 Cry毒素
        1.1.1 Cry毒素的空間結(jié)構(gòu)
        1.1.2 Cry毒素的Domain I
        1.1.3 Cry毒素的Domain II
        1.1.4 Cry毒素的Domain III
    1.2 Cry毒素的殺蟲機理模型
        1.2.1 Cry毒素的穿孔機制模型
        1.2.2 Cry毒素的信號轉(zhuǎn)導模型
    1.3 Cry毒素結(jié)合蛋白的鑒定
        1.3.1 堿性磷酸酶（ALP）
        1.3.2 氨肽酶N（APN）
        1.3.3 鈣黏蛋白（CAD）
        1.3.4 ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族（ABC transporter）
        1.3.5 其他Cry毒素的結(jié)合蛋白
    1.4 研究目的與意義
    1.5 研究內(nèi)容
        1.5.1 甜菜夜蛾與小菜蛾中腸液中Cry結(jié)合蛋白的分離
        1.5.2 甜菜夜蛾與小菜蛾中腸液中Cry結(jié)合蛋白的鑒定
        1.5.3 甜菜夜蛾與小菜蛾中腸液中Cry結(jié)合蛋白的理論結(jié)合驗證
        1.5.4 甜菜夜蛾與小菜蛾中腸液中Cry結(jié)合蛋白的克隆、表達及純化
        1.5.5 Cry7Ab4毒素活性區(qū)的表達及純化
第2章 材料與方法
    2.1 甜菜夜蛾中腸液Cry毒素結(jié)合蛋白的分離與鑒定
        2.1.1 供試昆蟲及Cry毒素
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器和器材
        2.1.4 甜菜夜蛾中腸液的提取
        2.1.5 甜菜夜蛾中腸液Cry毒素結(jié)合蛋白的Pull-down Essay
        2.1.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析Pull-down essay
        2.1.7 蛋白條帶的LS-MS/MS鑒定
        2.1.8 Discovery Studio 2.5 分子對接
        2.1.9 蛋白質(zhì)序列比對及空間結(jié)構(gòu)比對
    2.2 小菜蛾中腸液Cry毒素結(jié)合蛋白的分離與鑒定
        2.2.1 供試昆蟲與Cry毒素
        2.2.2 主要試劑、儀器和器材
        2.2.3 小菜蛾中腸液的提取
        2.2.4 小菜蛾中腸液Cry毒素結(jié)合蛋白的Pull-down Essay
        2.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析Pull-down essay
        2.2.6 蛋白條帶的LS-MS/MS鑒定
    2.3 甜菜夜蛾中腸液Cry結(jié)合蛋白POXC的表達及純化
        2.3.1 菌株和質(zhì)粒
        2.3.2 主要試劑
        2.3.3 主要儀器
        2.3.4 主要培養(yǎng)基
        2.3.5 主要溶液的配制
        2.3.6 Sepoxc基因克隆載體的構(gòu)建
        2.3.7 Sepoxc基因表達載體的構(gòu)建
        2.3.8 Sepoxc基因的誘導表達及純化
    2.4 小菜蛾中腸液Cry結(jié)合蛋白Dorsal的表達及純化
        2.4.1 菌株和質(zhì)粒
        2.4.2 主要試劑及儀器
        2.4.3 Pxdorsal基因克隆載體及表達載體的構(gòu)建
        2.4.4 pGEX-Dorsal質(zhì)粒在BL21(DE3)中的誘導表達
    2.5 Cry7Ab4毒素活性區(qū)的表達及純化
        2.5.1 菌株和質(zhì)粒
        2.5.2 主要試劑及儀器
        2.5.3 Cry7Ab4基因活性區(qū)克隆載體的構(gòu)建
        2.5.4 Cry7Ab4基因活性區(qū)表達載體的構(gòu)建
        2.5.5 Cry7Ab4基因的誘導表達及純化
第3章 結(jié)果與分析
    3.1 甜菜夜蛾中腸液中Cry1Ab1結(jié)合蛋白的分離與鑒定
    3.2 甜菜夜蛾中腸液中Cry1Ab1結(jié)合蛋白SePOXC的克隆、表達與純化
        3.2.1 Sepoxc全基因合成及克隆載體的構(gòu)建
        3.2.2 Sepoxc基因表達載體的構(gòu)建
        3.2.3 Sepoxc基因的誘導表達
        3.2.4 蛋白濃度標準曲線
        3.2.5 SePOXC蛋白的純化
    3.3 小菜蛾中腸液中Cry1Ab1結(jié)合蛋白的分離與鑒定
    3.4 小菜蛾dorsal基因的克隆、表達及純化
        3.4.1 Pxdorsal全基因合成及克隆載體及表達載體的構(gòu)建
        3.4.2 Pxdorsal基因的誘導表達
        3.4.3 PxDorsal蛋白的純化
    3.5 Cry7Ab4基因的表達
        3.5.1 Cry7Ab4基因活性區(qū)克隆載體的構(gòu)建
        3.5.2 Cry7Ab4基因活性區(qū)表達載體的構(gòu)建
        3.5.3 Cry7Ab4基因的誘導表達
第4章 討論
    4.1 小菜蛾Dorsal與昆蟲免疫反應
    4.2 甜菜夜蛾P(guān)OXC功能的推測
    4.3 Cry7Ab4毒素及其結(jié)合蛋白的分離鑒定
    4.4 結(jié)論與后續(xù)工作
參考文獻
致謝
個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術(shù)論文與研究成果



本文編號：3829005