辣椒溶桿菌(Lysobacter capsici)X2-3是本實驗室從小麥根際土壤中分離得到的一株溶桿菌菌株,對多種植物病原真菌和卵菌具有明顯的拮抗活性。該菌株菌落表面光滑,GC%含量高,具有很強的滑動性。本研究以L.capsici X2-3為出發(fā)菌株,構(gòu)建了X2-3轉(zhuǎn)座子隨機插入突變體庫,從突變體庫中篩選生物膜表型變化的突變株,并對突變體MT4的相關(guān)基因功能進行了分析。取得的主要研究結(jié)果如下:1.隨機插入突變體庫構(gòu)建利用Tn5隨機插入法對X2-3進行轉(zhuǎn)座誘變,獲得了4800余個插入突變體。以生物膜表型特征為依據(jù),篩選得到了7株生物膜表型變化的突變株,分別命名為MT1-MT7。通過質(zhì)粒拯救法,確定了Tn5在不同突變體中插入的目的基因位點,其中3個突變株插入位點在同一個基因LC0409,其余4個突變體插入位點分別在基因LC3417,LC3753,LC4356和LC0306。2.突變體MT4插入基因的功能預測對突變株MT4插入基因在GenBank中比對分析,發(fā)現(xiàn),該基因編碼GntR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其氨基酸序列與辣椒溶桿菌L.capsici(ID:ALN83455)氨基酸序列相似性達到10...

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【學位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 溶桿菌的研究進展
        1.1.1 溶桿菌屬的分類地位
        1.1.2 溶桿菌屬的生物學特性
        1.1.3 辣椒溶桿菌(L.capsici)的研究進展
    1.2 轉(zhuǎn)座子插入突變
        1.2.1 轉(zhuǎn)座子
        1.2.2 側(cè)翼序列的獲得
            1.2.2.1 Plasmid rescue(質(zhì)粒拯救)技術(shù)
            1.2.2.2 IPCR(Inverse PCR)技術(shù)
            1.2.2.3 TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interiaced PCR)技術(shù)
            1.2.2.4 PCR-Walking(PCR步移)技術(shù)
        1.2.3 轉(zhuǎn)座子插入突變在細菌功能研究中的應(yīng)用
    1.3 細菌生物膜
        1.3.1 生物膜形成過程
        1.3.2 生物膜結(jié)構(gòu)和組成
        1.3.3 生物膜的作用
    1.4 GntR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子
        1.4.1 GntR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的特性
        1.4.2 GntR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的功能
    1.5 本研究的目的及意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 主要實驗儀器
        2.1.4 酶與試劑
        2.1.5 引物
    2.2 實驗方法
        2.2.1 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化
            2.2.1.1 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的制備
            2.2.1.2 感受態(tài)細胞的電轉(zhuǎn)化
        2.2.2 突變體的篩選及質(zhì)粒拯救法鑒定側(cè)翼序列
            2.2.2.1 突變體的篩選
            2.2.2.2 突變體生物膜表面形態(tài)變化的驗證
            2.2.2.3 細菌基因組DNA提取
            2.2.2.4 PCR驗證
            2.2.2.5 基因組DNA的酶切
            2.2.2.6 酶切產(chǎn)物的純化
            2.2.2.7 純化酶切產(chǎn)物的連接
            2.2.2.8 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
            2.2.2.9 質(zhì)粒DNA的小量提取
            2.2.2.10 轉(zhuǎn)化
        2.2.3 突變體突變基因功能互補
            2.2.3.1 突變基因的獲得
            2.2.3.2 PCR產(chǎn)物的回收
            2.2.3.3 重組載體Blunt-4356 的構(gòu)建及驗證
            2.2.3.4 重組載體Blunt-4356 的酶切和回收
            2.2.3.5 表達載體pBBR1MCS-5 的酶切和回收
            2.2.3.6 重組表達載體PBBR1-4356 的構(gòu)建及驗證
            2.2.3.7 重組表達載體PBBR1-4356 與突變菌株的電轉(zhuǎn)化
            2.2.3.8 LC4356 基因互補突變體的篩選
        2.2.4 熒光定量PCR
            2.2.4.1 RNA的提取
            2.2.4.2 反轉(zhuǎn)錄合成c DNA
            2.2.4.3 熒光定量PCR擴增
            2.2.4.4 數(shù)據(jù)分析
        2.2.5 野生株、突變株和回復株的表型及活性分析
            2.2.5.1 生長曲線的測定
            2.2.5.2 生物膜的測定
            2.2.5.3 抑菌活性的測定
            2.2.5.4 胞外多糖的測定
            2.2.5.5 滑動性的測定
            2.2.5.6 抗逆性的測定
3 結(jié)果與分析
    3.1 突變體的篩選和驗證
        3.1.1 突變體的篩選
        3.1.2 突變體的驗證
        3.1.3 突變體側(cè)翼序列的確認
    3.2 突變體MT4 的插入基因及生物學特性
        3.2.1 LC4356 基因的分析
        3.2.2 突變體和野生株菌落形態(tài)的變化
        3.2.3 突變體和野生株生物膜產(chǎn)量的變化
        3.2.4 突變體和野生株抑菌活性的變化
    3.3 突變體MT4 突變基因互補
        3.3.1 LC4356 基因的PCR擴增
        3.3.2 重組載體的構(gòu)建
        3.3.3 重組表達載體PBBR1-4356 的酶切
        3.3.4 回復菌株MCS-4356 的篩選及驗證
    3.4 GntR對上游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
        3.4.1 菌株RNA提取
        3.4.2 反轉(zhuǎn)錄成c DNA
        3.4.3 熒光定量PCR
    3.5 野生株和突變株生物膜及生物學特性變化
        3.5.1 GntR的突變對生長的影響
        3.5.2 GntR的突變對生物膜產(chǎn)量的影響
        3.5.3 GntR的突變對胞外多糖產(chǎn)量的影響
        3.5.4 GntR的突變對運動性的影響
        3.5.5 野生株與突變株抗逆性的比較
4 討論
    4.1 EZ-Tn5 隨機插入突變體的篩選和側(cè)翼序列分析
    4.2 LC4356 基因回復菌株的構(gòu)建
    4.3 突變體生物學相關(guān)特性及抗逆性的研究
    4.4 GntR家族基因LC4356對其上游基因的調(diào)節(jié)作用
5 結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間論文發(fā)表情況



本文編號：3829301