香蕉穿孔線蟲[Radopholus similis(Cobb,1893)Thorne,1949]是一種內(nèi)寄生植物病原線蟲,嚴(yán)重危害多種經(jīng)濟(jì)作物以及觀賞植物�；瘜W(xué)防治是如今對香蕉穿孔線蟲最常用的防治方法,但是化學(xué)殺線劑的過量使用嚴(yán)重污染環(huán)境和危害人類健康,因此以生物技術(shù)為策略、以線蟲寄生致病基因?yàn)榘袠?biāo)的可持續(xù)防治該線蟲的新方法已成為關(guān)注的熱點(diǎn)。在靶標(biāo)基因功能分析研究中,需要根據(jù)試驗(yàn)因素選擇理想的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化,保證定量分析的準(zhǔn)確性。但是迄今尚未有香蕉穿孔線蟲內(nèi)參基因的研究報(bào)道。乙酰輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Acetyl-coenzyme A transporter,ACATN)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的多重跨膜蛋白,參與神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸的O-乙�；^程。研究香蕉穿孔線蟲ACATN有助于獲得更多潛在的靶標(biāo)基因。但是目前尚未有植物寄生線蟲ACATN基因(acatn)的報(bào)道。本研究利用香蕉穿孔線蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和qPCR技術(shù)篩選香蕉穿孔線蟲的理想內(nèi)參基因,并從該數(shù)據(jù)庫中篩選克隆了香蕉穿孔線蟲acatn,利用篩選出的內(nèi)參基因?qū)υ揳catn進(jìn)行定量分析,獲得的主要研究結(jié)果如下:1、利用生物信息學(xué)的方法在香蕉穿孔...

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 前言
    1.1 香蕉穿孔線蟲研究概況
        1.1.1 香蕉穿孔線蟲的分布及其經(jīng)濟(jì)重要性
        1.1.2 香蕉穿孔線蟲的寄主范圍及危害癥狀
        1.1.3 香蕉穿孔線蟲的生物學(xué)特性及致病性
        1.1.4 香蕉穿孔線蟲的防治措施
    1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR概況
        1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡介
        1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)越性及應(yīng)用
        1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果影響因素
    1.3 內(nèi)參基因及其應(yīng)用和選擇
        1.3.1 內(nèi)參基因簡介
        1.3.2 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的分析方法
    1.4 乙酰輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究概況
    1.5 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 供試香蕉穿孔線蟲
        2.1.2 菌株和質(zhì)粒載體
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 主要試劑
        2.1.5 主要溶液和培養(yǎng)基的制備
    2.2 方法
        2.2.1 香蕉穿孔線蟲的擴(kuò)繁
            2.2.1.1 胡蘿卜愈傷組織的培養(yǎng)
            2.2.1.2 供試香蕉穿孔線蟲的分離和擴(kuò)繁
        2.2.2 香蕉穿孔線蟲總RNA的提取
            2.2.2.1 香蕉穿孔線蟲不同種群混合蟲態(tài)總RNA的提取
            2.2.2.2 香蕉穿孔線蟲不同蟲態(tài)RNA的提取
        2.2.3 cDNA的合成
        2.2.4 候選內(nèi)參基因的挖掘和克隆分析
            2.2.4.1 候選內(nèi)參基因的挖掘
            2.2.4.2 引物設(shè)計(jì)
            2.2.4.3 PCR反應(yīng)
            2.2.4.4 瓊脂糖凝膠DNA回收
            2.2.4.5 連接反應(yīng)
            2.2.4.6 轉(zhuǎn)化
            2.2.4.7 目的片段的測序
        2.2.5 候選內(nèi)參基因的篩選
            2.2.5.1 引物的設(shè)計(jì)
            2.2.5.2 普通PCR檢測引物
            2.2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
            2.2.5.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
            2.2.5.5 數(shù)據(jù)分析
        2.2.6 香蕉穿孔線蟲Rs-acatn-1 基因全長擴(kuò)增和生物信息學(xué)分析
            2.2.6.1 RACE-Ready cDNA的準(zhǔn)備
            2.2.6.2 RACE的引物設(shè)計(jì)
            2.2.6.3 5’RACE和 3’RACE的擴(kuò)增
            2.2.6.4 基因開放閱讀框ORF的獲得
            2.2.6.5 Rs-acatn-1 基因DNA序列的獲得
            2.2.6.6 Rs-acatn-1 基因序列分析和蛋白功能預(yù)測
        2.2.7 Rs-acatn-1 表達(dá)量的分析
            2.2.7.1 引物的設(shè)計(jì)
            2.2.7.2 Rs-acatn-1 基因在不同蟲態(tài)的表達(dá)量
3 結(jié)果與分析
    3.1 總RNA提取檢測
    3.2 候選內(nèi)參基因克隆
    3.3 候選內(nèi)參基因的篩選
        3.3.1 引物特異性分析
            3.3.1.1 普通PCR對引物的檢測
            3.3.1.2 候選內(nèi)參基因溶解曲線的分析
        3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
        3.3.3 候選內(nèi)參基因表達(dá)豐度分析
        3.3.4 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析
            3.3.4.1 BestKeeper分析
            3.3.4.2 geNorm分析
            3.3.4.3 Norm Finder分析
    3.4 香蕉穿孔線蟲Rs-acatn-1 的克隆和分析
        3.4.1 香蕉穿孔線蟲Rs-acatn-1 基因的克隆
        3.4.2 Rs-acatn-1 基因ORF的擴(kuò)增及分析
        3.4.3 Rs-acatn-1 基因組基因編碼區(qū)的擴(kuò)增及分析
        3.4.4 香蕉穿孔線蟲Rs-ACATN-1 的生物信息學(xué)分析
            3.4.4.1 Rs-ACATN-1 的理化性質(zhì)
            3.4.4.2 Rs-ACATN-1 同源性分析
            3.4.4.3 Rs-ACATN-1 信號肽預(yù)測
            3.4.4.4 Rs-ACATN-1 跨膜區(qū)預(yù)測
    3.5 Rs-acatn-1 表達(dá)量分析
4 結(jié)論與討論
    4.1 香蕉穿孔線蟲內(nèi)參基因的篩選
    4.2 Rs-acatn-1 基因的克隆和功能研究
    4.3 研究的創(chuàng)新性和展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄



本文編號：3828873