由條形柄銹菌小麥專(zhuān)化型（Puccinia striiformis f.sp.tritici）引致的小麥條銹病對(duì)我國(guó)和全球小麥種植造成嚴(yán)重危害。由于缺乏可靠的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù),目前對(duì)小麥條銹菌的重要基因及致病機(jī)理尚不清楚。效應(yīng)蛋白,一類(lèi)由病原菌分泌的、干擾或損害寄主植物生理代謝和防衛(wèi)反應(yīng)、增加寄主易感性從而助于侵染的小分子蛋白,在病原菌的致病過(guò)程中發(fā)揮非常重要的作用。而根據(jù)“基因?qū)蚣僬f(shuō)”,當(dāng)植物體內(nèi)存在能識(shí)別這些蛋白的R基因時(shí),R蛋白與這些效應(yīng)蛋白發(fā)生互作,向下游傳遞抗病信號(hào)引發(fā)更為激烈的免疫反應(yīng),這些被識(shí)別的效應(yīng)蛋白發(fā)揮無(wú)毒性功能。因而,分析效應(yīng)蛋白的功能、找到與它發(fā)生互作的關(guān)鍵標(biāo)靶蛋白,可進(jìn)一步明確效應(yīng)蛋白的具體作用,揭示小麥條銹菌的致病機(jī)制與寄主的防御機(jī)理。為此,本論文在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取了含有核定位信號(hào)的Pst19032效應(yīng)蛋白進(jìn)行了深入研究,主要研究結(jié)果如下:（1）通過(guò)分析該基因的種間和種內(nèi)多態(tài)性,發(fā)現(xiàn)該基因非常保守;（2）實(shí)時(shí)熒光定量分析發(fā)現(xiàn),Pst19032在侵染的中期和后期出現(xiàn)兩個(gè)表達(dá)高峰,推測(cè)其功能具有多樣性;（3）通過(guò)構(gòu)建熒光載體進(jìn)行小麥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的研究發(fā)現(xiàn),該效... 

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【部分圖文】：

植物與病菌互作中植物免疫系統(tǒng)的“Z”字模型（JonesandDangl,2006）

4小麥條銹菌效應(yīng)蛋白Pst19032功能分析及互作靶標(biāo)鑒定圖1-1植物與病菌互作中植物免疫系統(tǒng)的“Z”字模型（JonesandDangl,2006）Figure1-1."Zigzag"modeloftheplantimmunesystemintheinteractionbetweenplantsandpathogens1.2.2特異結(jié)構(gòu)：吸器銹菌作為活體寄生型的病原物，在侵染過(guò)程中其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都來(lái)自于寄主植物細(xì)胞。在侵染期間，真菌菌絲在葉片的細(xì)胞間隙生長(zhǎng)，通過(guò)吸器這一特異結(jié)構(gòu)與宿主形成密切聯(lián)系。吸器在破壞寄主細(xì)胞壁后，將進(jìn)一步在植物細(xì)胞質(zhì)膜中擴(kuò)張，并構(gòu)成獨(dú)特的寄主—病原體界面。吸器是銹菌從植物中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要方式（VoegeleandMendgen,2003），是病原菌抵抗植物識(shí)別的重要場(chǎng)所，同時(shí)很多寄主免疫響應(yīng)也在此開(kāi)始（Heathetal.1997;HahnandMendgen,2001）。在這里發(fā)生的動(dòng)態(tài)相互作用包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸，信號(hào)傳導(dǎo)和防御反應(yīng)等。吸器作為銹菌與寄主植物之間的交流場(chǎng)所，有很多蛋白質(zhì)集中在這個(gè)區(qū)域發(fā)揮作用�，F(xiàn)有的研究證明銹菌病原物分泌的效應(yīng)蛋白大多數(shù)通過(guò)吸器進(jìn)入寄主細(xì)胞，以促進(jìn)感玻圖1-2效應(yīng)蛋白在吸器處表達(dá)（Koecketal.2011）Figure1-2.Schematicdiagramoftheexpressionoftheeffectorproteins

第二章材料與方法19液10mL，充分重懸細(xì)胞后再次離心；重復(fù)前一步驟一次，棄上清后再用5mL的10mMMgCl2溶液重懸細(xì)胞，測(cè)OD。此外，含BAX的農(nóng)桿菌抗性為慶大；測(cè)OD后用10mMMgCl2溶液將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的濃度都稀釋到0.3，黑暗靜置2h后可用。2.2.4.2注射侵染用1mL注射器進(jìn)行注射。操作時(shí)先用針頭在煙草葉片上輕輕刺孔注意不要穿透葉片，之后推動(dòng)活塞吸取菌液并接觸葉片進(jìn)行注射暈染。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抑制BAX引起的壞死實(shí)驗(yàn)中盡量將侵染范圍控制成圓斑形狀，記好各侵染斑的位置與對(duì)應(yīng)的基因，在盆壁上進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)記。1d后，在同一圓斑注射含BAX的農(nóng)桿菌菌液，一周后進(jìn)行壞死觀察。分布情況：圖2-1基因分布圖Figure2-1.Thedistributionofgenes2.2.5利用熒光假單胞Ⅲ型分泌系統(tǒng)驗(yàn)證效應(yīng)蛋白功能2.2.5.1pEDV6載體的構(gòu)建在本實(shí)驗(yàn)中，將克隆得到的Pst19032構(gòu)建到pEDV6載體，提質(zhì)粒、酶切與檢測(cè)步驟同2.2.3.1中所述。連接反應(yīng)，由于pED6含有Gateway元件，故用gateway方法進(jìn)行載體構(gòu)建，具體分為BP、LR反應(yīng)兩步，注意的是終載pEDV6的抗性為慶大霉素。Gateway方法構(gòu)建載體BP反應(yīng)體系（10μL）attB-PCR產(chǎn)物1~7μL（15~150ng）PDONR載體（150ng/μL）1.0μLBPClonaseTMIIenzymemix2.0μLTEBuffer（PH8.0）upto10μL加樣后瞬離混勻，25℃，1h以上（過(guò)夜更好），取出后加入1μL的蛋白酶K，37℃，10min終止反應(yīng)。將BP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10中，提質(zhì)粒得到Entryclone，進(jìn)行LR反應(yīng)得到終載。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號(hào)：3615104