發(fā)布時間：2022-01-13 20:22

　　赤霉病是世界范圍內(nèi)小麥上重要的真菌病害,在溫暖潮濕地區(qū)廣泛發(fā)生,影響小麥產(chǎn)量的同時,產(chǎn)生的毒素危害著人畜的生命健康。其有性生殖形成的子囊殼是該菌越冬的主要形式。同時有性孢子（子囊孢子）也是該病流行的初侵染源。有性生殖還保持了菌群致病力相關(guān)基因的遺傳多樣性和穩(wěn)定性,從而提高其對宿主植物的適應(yīng)能力。因此對有性生殖發(fā)育的理解是綜合控制赤霉病的先決條件。光作為影響生物生長發(fā)育最重要的環(huán)境因子之一,對真菌的生長發(fā)育、代謝活動及生理周期等產(chǎn)生至關(guān)重要的調(diào)控作用。同時由于赤霉病主要的致病真菌禾玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae（Schw.）Petch）在室內(nèi)需要在近藍光下才可誘導(dǎo)形成子囊殼,因此,推測藍光受體蛋白在玉蜀黍赤霉有性生殖發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用。本文以該菌為研究對象,利用反向遺傳學(xué)的手段,對預(yù)測出的藍光受體相關(guān)基因Fgwc1、Fgwc2和Fgvvd進行了功能分析,以期更好地理解光信號在玉蜀黍赤霉有性生殖發(fā)育及致病過程中發(fā)揮的作用。主要研究結(jié)果如下:（1）首先從禾谷鐮刀菌數(shù)據(jù)庫中獲得預(yù)測的藍光受體相關(guān)基因Fgwc1、Fgwc2和Fgvvd的基因序列。同時進行生物信息學(xué)分析,表明Fg... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

敲除轉(zhuǎn)化片段示意圖

2. 挑取 20~40mm菌絲塊于提取液中，用研磨棒研磨約 10s。3. 5000rpm，離心 10min，吸取上清加 0.3ml 異丙醇中。4. 輕輕混勻幾次，出現(xiàn) DNA 絮狀，12000rpm 離心 10min。5. 去上清，用 0.8ml 70%酒精清洗。離心，棄酒精，吹干。6. 加入 50μl 去離子水或者 EB，溶解 DNA。1.2.8 Fgwc1、Fgwc2 回復(fù)引物的設(shè)計1.2.9 Fgwc1、Fgwc2 回復(fù)片段的構(gòu)建（1）Fgwc1 回復(fù)片段的構(gòu)建回復(fù)片段的構(gòu)建主要根據(jù)突變體菌株中潮霉素抗性基因的上下游序列與野生菌株中的相應(yīng)位置上下游序列同源，利用 Split Marker 方法恢復(fù)敲除菌株中被敲除的Fgwc1 基因。實驗中所用引物用 DNA STAR 引物設(shè)計軟件設(shè)計，由武漢天一輝遠有限公司合成（如圖 2-2）。

圖 2-3 回復(fù)轉(zhuǎn)化片段示意圖Fig 2-3 The structure of fragment for complementation transformation過同源重組構(gòu)建回復(fù)片段，將被敲除的基因回復(fù)回去，同時加入 G418 抗性基因作為篩選標(biāo)記基因。uilding of gene-complementation cassettes by recombinational cloning, replacing of knocked-out gene withygromycin resistance gene，and add the G418 resistance gene as the screening marker gene.第一步，根據(jù)野生型菌株 PH-1 中基因 Fgwc2 以及上下游同源序列設(shè)計引物，提取的野生型菌株 PH-1 的 DNA 為模板，用引物 WC-2 HB'5F/WC-2 HB'5R 擴增因 Fgwc2 以及相連的上游同源序列共計 2140 bp，即左側(cè)片段 5’（片段 5’），用物 WC-2 HB'3F/WC-2 HB'3R 擴增 Fgwc2 的下游同源序列 1830 bp，即右側(cè)片段 3’片段 3’）。以質(zhì)粒 Pbsh 為模板用引物 FLAG-1-5'F/revG418-3R 擴增 Flag+TrpC止子+G418 抗性基因 2294 bp。CR 反應(yīng)體系：模板 DNA 2.0 μldNTP（10 mmol/L） 4.0 μlTaq DNApolymerase 1.0 μl

【參考文獻】：
期刊論文
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[2]淺析小麥赤霉病的發(fā)病原因與防治措施[J]. 萬育民,喬偉.  種子科技. 2012(06)
[3]冀、京、津產(chǎn)麥區(qū)小麥赤霉病菌原體形成期的氣象要素演變特征與分析[J]. 袁淑杰,梁平,武文輝,徐大紅,楊昌銀,韓俊玲,李智慧.  華北農(nóng)學(xué)報. 2007(S2)
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