馬鈴薯為世界第四大糧食作物,在種植過(guò)程中易受病毒感染。馬鈴薯紡錘莖塊類病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）是一種嚴(yán)重危害馬鈴薯生產(chǎn)的類病毒,當(dāng)前對(duì)PSTVd的生物學(xué)特性、檢測(cè)技術(shù)、基因組預(yù)測(cè)序等研究已較成熟,但其復(fù)制、轉(zhuǎn)運(yùn)及致病機(jī)理尚不明晰。PSTVd基因組中包含27個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu),其具體功能尚不明晰。基于病毒、類病毒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、RNA分子較小的特殊性.利用病毒、類病毒進(jìn)行RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及功能研究是當(dāng)前研究中的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù),獲得了一個(gè)PSTVd分離物;并通過(guò)關(guān)閉PSTVd的部分莖環(huán)結(jié)構(gòu)獲得不同突變體,之后利用原位雜交技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)了解了關(guān)閉莖環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)PSTVd轉(zhuǎn)運(yùn)與復(fù)制的影響;此外,也基于高通量測(cè)序技術(shù)分析了 PSTVd在煙草中的變異特點(diǎn)。主要研究?jī)?nèi)容如下:（1）以馬鈴薯塊莖為實(shí)驗(yàn)材料,提取總RNA,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到359bp特異性條帶,后經(jīng)過(guò)克隆、測(cè)序,顯示此分離物與GenBank中其它PSTVd分離物的同源性為 96.5%-98.1%。（2）以煙草葉片為實(shí)驗(yàn)材料,利用纖維素酶和果膠酶制備的酶液避光酶解煙草葉片,再... 

【文章來(lái)源】：東北林業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１馬鈴薯總ＲＮＡ提取電泳結(jié)果??Ｍ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?１－２：不同馬鈴薯樣品??

２?ＰＳＴＶｄ?的?ＲＴ－ＰＣＲ?檢測(cè)??２．３．２?ＰＣＲ?檢測(cè)??利用ＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)，對(duì)馬鈴薯塊莖中的ＰＳＴＶｄ進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增出了預(yù)期３５９ｂｐ的??片段，如圖２－２中Ａ所示。利用ＤＮＡ純化試劑盒對(duì)ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行了純化，如圖２－２中??Ｂ所示，去除ＰＣＲ產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、寡核苷酸及其他有機(jī)物，有利于后續(xù)測(cè)??序反應(yīng)。??Ａ?Ｍ?１?２?ＮＴＣ?Ｂ?Ｍ?１?２?ＮＴＣ??＿??２０００ｂｐ—２０００ｂｐ—??１０００ｂｐ—１〇〇〇ｂｐ—??７５０ｂｐ—７５０ｂｐ—??５〇〇ｂｐ－＾｜．?ｒ??圖２－２?ＰＳＴＶｄ?ＲＴ－ＰＣＲ產(chǎn)物電泳結(jié)果??圖Ａ：純化前的ＰＣＲ產(chǎn)物，圖Ｂ：純化后的ＰＣＲ產(chǎn)物。Ｍ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?１－２：馬鈴薯樣品，??ＮＴＣ：對(duì)照??２．３．３?ＰＳＴＶｄ序列比對(duì)與分析??對(duì)純化ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，將測(cè)序得到的序列在ＮＣＢＩ上進(jìn)行ＢＬＡＳＴ分析。??ＢＬＡＳＴ分析顯示測(cè)序結(jié)果與ＧｅｎＢａｎｋ中其它ＰＳＴＶｄ分離物的同源性為９６．５％？９８．１％，??因此確定該序列為ＰＳＴＶｄ特異序列。與ＰＳＴＶｄ基因組全序列、ＰＳＴＶｄ美國(guó)地區(qū)分離物??序列進(jìn)行了多序列比對(duì)，如圖２－３所示，結(jié)果顯示此分離物缺失部分起始片段，另有１７??個(gè)堿基發(fā)生變異，差異堿基主要集中在基因組兩端。??構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析本研究分離物與其他分離物的關(guān)系，如圖２－４所示。１３個(gè)不同??分離物分成兩個(gè)亞組，分析顯示本研究中的分離物與加拿大、美國(guó)地區(qū)分離物的親緣關(guān)??系較近，與新西蘭、伊朗、荷蘭地區(qū)分離物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。??－１３－??

圖２－４?ＰＳＴＶｄ系統(tǒng)發(fā)育樹??Ｐｏｔａｔｏ?ｓｐｉｎｄ］ｅ?ｔｕｂｅｒ?ｖｉｒｏｉｄ：本研究中獲得的ＰＳＴＶｄ分離物??


本文編號(hào)：3587502