發(fā)布時間：2020-11-05 03:43

　　 馬麝是國家Ⅰ級重點保護(hù)野生動物,由于被持續(xù)的過度捕殺和棲息地縮減等因素,越來越瀕危。另一方面,高致病率和死亡率一直是該物種人工馴養(yǎng)的重要障礙。馬麝屬于反芻動物,腸道微生物對其生存具有很大的意義。腸道中存在的微生物群落是物種長期進(jìn)化的結(jié)果,與動物的食性、機(jī)體免疫、營養(yǎng)需求等關(guān)系密切。長期的圈養(yǎng)改變馬麝的食物搭配,導(dǎo)致腸道微生物的變化,可能降低其免疫力,使其易發(fā)疾病。對野外馬麝來說,在食物短缺的冬季,如何從高纖維的食物中吸收更多的營養(yǎng)也是其生存的關(guān)鍵。從野外馬麝和圈養(yǎng)馬麝腸道菌群的差異出發(fā),探討不同生存狀態(tài)下兩組馬麝腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)、多樣性和菌群功能等方面的差異;挖掘腸道菌群中的優(yōu)勢菌群、差異菌群并對其相關(guān)的代謝通路進(jìn)行分析。通過對兩個馬麝種群的腸道菌群進(jìn)行對比研究幫助我們獲得宿主的營養(yǎng)吸收、抗生素使用情況、易患疾病等諸多方面信息,進(jìn)而為該珍稀野生動物的保護(hù)及其腸道微生物的研究奠定基礎(chǔ)。采用高通量測序的技術(shù),對野外和圈養(yǎng)馬麝的腸道菌群分別做16SrRNA測序和宏基因組測序分析。研究結(jié)果如下:1.基于16SrRNA測序的野外馬麝和圈養(yǎng)馬麝冬季腸道菌群結(jié)構(gòu)及差異分析基于16S rRNA測序?qū)δc道微生物進(jìn)行注釋分類,確定了在馬麝腸道微生物中豐度最高的10個門。它們在野外馬麝(W)和圈養(yǎng)馬麝(C)組中的相對豐度分別為:厚壁菌門(Firmicutes:85.27%,59.80%)、擬桿菌門(Bacteroidetes:10.30%,29.23%)、螺旋體門(Spirochaetes:0.11%,2.98%)、變形菌門(Proteobacteria:1.17%,3.14%)、軟壁菌門(Tenericutes:1.26%,1.20%)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria:0.49%,0.49%)、纖維桿菌門(Fibrobacteres:0.03%,0.30%)、疣微菌門(Verrucomicrobia:0.14%,0.11%)、放線菌門(Actinobacteria:0.61%,0.42%)和廣古菌門(Euryarchaeota:0.06%,0.32%)。通過對比發(fā)現(xiàn),兩組馬麝的腸道菌群在總體結(jié)構(gòu)上相似,厚壁菌門和擬桿菌門均是優(yōu)勢菌門,但在菌種比例上差異顯著。作為反映機(jī)體營養(yǎng)吸收和能量代謝的重要指標(biāo)之一,厚壁菌門和擬桿菌門的比例(F/B)在W組顯著高于C組(W:8.28,C:2.05)。高比例的厚壁菌種可以幫助機(jī)體從食物中吸收更多的營養(yǎng)并造成脂肪沉積。這是野外馬麝為適應(yīng)食物資源貧瘠的冬季而形成的生理機(jī)制。馬麝腸道菌群中豐度最高的10個屬為5-7N15、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、梭菌屬(Clostridium)、密螺旋體屬(Treponema)、羅氏菌屬(Roseburia)、擬桿菌屬(Bacteroides)、顫螺菌屬(Oscillospira)、Anaerostipes、糞球菌屬(Coprococcus)和Dorea。其中在兩組馬麝中相對豐度差異最大的菌屬是密螺旋體屬。存在于所有馬麝糞便樣品中的核心菌有:羅氏菌屬、糞球菌屬、梭菌屬、顫螺菌屬、Blautia rc4-4、瘤胃球菌屬和5-7N15。除了 5-7N15屬于擬桿菌門,其余核心屬皆屬于厚壁菌門。其中大部分的核心菌屬都有產(chǎn)生SCFA(short chain fatty acid;短鏈脂肪酸)的功能。2.野外和圈養(yǎng)馬麝冬季腸道菌群多樣性差異分析和顯著差異菌種分析通過對野外馬麝和圈養(yǎng)馬麝的a多樣性和β多樣性的分析,對兩組樣品組內(nèi)和組間各個樣品的相似性,樣品中所含的細(xì)菌的數(shù)目、豐度、菌群結(jié)構(gòu)差異和樣品多樣性的差異做了詳細(xì)、深入的研究�？傮w來講,兩組樣品存在明顯的分離現(xiàn)象,且組間樣品差異要比組內(nèi)樣品差異顯著。W組內(nèi)各樣品中微生物多樣性差異較大,但是總體略低于C組內(nèi)各樣品中微生物多樣性。可見,十幾年的馴養(yǎng)過程并未顯著降低馬麝腸道菌群的多樣性。通過T-test檢驗和LEfSe分析組間顯著差異菌屬發(fā)現(xiàn),兩組馬麝腸道菌群具有顯著差異的菌屬在W組中豐度較高的多為厚壁菌門,包括:梭菌屬、羅氏菌屬、顫螺菌屬、Anaerostipes、腸球菌屬(Enterococcus)、Dorea、Blautia、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和Faecalibacterium。在C組豐度較高的屬多屬于擬桿菌門和螺旋體門,其中有:密螺旋體屬、5-7N15、瘤胃球菌屬、擬桿菌屬、Paludibacter、普氏菌屬(Prevotella)、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、Paraprevotella 和希瓦氏菌屬(Shewanella)。3.基于宏基因組測序的野外和圈養(yǎng)馬麝冬季腸道菌群功能差異分析基于高通量測序的手段,從代謝通路(KEGG),同源基因簇(eggNOG),碳水化合物酶(CAZy)的功能注釋三個方面進(jìn)行馬麝腸道菌群的功能分析�；贙EGG的信號通路,統(tǒng)計了野外和圈養(yǎng)馬麝各自獨有的酶類反應(yīng),其中代表野外馬麝獨有的酶類反應(yīng)有:K06045(squalene-hopene/tetraprenyl-beta-curcumene cyclase),K01047(secretory phospholipase A2),K00036(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase),K00832(aromatic-amino-acid transaminase),K00022(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase)和K01692(enoyl-CoA hydratase)等。這些酶類主要參與的生物過程包括:萜類化合物和聚酮化合物的代謝,倍半萜類和三萜類生物合成,短鏈脂肪酸的合成和代謝,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。據(jù)此推測,野外馬麝腸道菌群中含有高豐度的與產(chǎn)生SCFA相關(guān)的細(xì)菌,除了為機(jī)體供能以外,也幫助它們抵御一些腸道疾病的發(fā)生。碳水化合物酶的注釋,共有4883個基因注釋到37個糖基轉(zhuǎn)移酶家族(GTs),涉及到的主要酶類包括纖維素合酶、幾丁質(zhì)合酶、磷酸二醇酯D-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶淀粉葡糖基轉(zhuǎn)移酶、透明質(zhì)酸合酶和幾丁質(zhì)寡糖合酶等。在所有催化糖類酯化反應(yīng)的碳水化合物酯酶(CEs)中,馬麝宏基因組中豐度最高的為CE4,占該家族注釋基因數(shù)目的32.9%。CE4和CE9在野外馬麝的腸道宏基因組中的基因相對豐度均高于圈養(yǎng)馬麝組。這兩個水解酶家族的主要酶類包括乙酰木聚糖酯酶、殼多糖脫乙酰酶、殼寡糖脫乙酰酶、甲殼素脫乙酰酶和N-乙酰葡糖胺脫乙酰酶,這些酶類均與消化細(xì)菌細(xì)胞壁的胞壁質(zhì)、霉菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)、真菌和植物的細(xì)胞壁有關(guān)。對比食性研究,可以推測,甲殼素酶在野外馬麝腸道宏基因組中的高豐度或與食用較多的真菌有關(guān),這一點也印證了食物和腸道菌群功能的相關(guān)性�？傮w來講,馬麝的腸道菌群是食物、生長環(huán)境和自身生理特點綜合作用的結(jié)果。同樣,腸道菌群對宿主的營養(yǎng)吸收和能量代謝也發(fā)揮著重要的作用。野外馬麝腸道菌群高厚壁菌門的結(jié)構(gòu)特點幫助機(jī)體從食物中汲取更多的營養(yǎng),同時產(chǎn)生大量的SCFA,可幫助機(jī)體抵抗炎癥。另外,植物代謝產(chǎn)生的二級代謝產(chǎn)物如萜類化合物對機(jī)體也有重要的保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S865.41
【部分圖文】：

能快速準(zhǔn)確的得到大量生物數(shù)據(jù)和豐富的微生物研宄信息，從而成為研宄微生物多樣性??和群落特征的重要手段。宏基因組測序主要流程是：環(huán)境中的基因組ＤＮＡ的提��；宏??基因組文庫的構(gòu)建和篩選；基因活性產(chǎn)物表達(dá)。Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ信息分析流程如圖１－１。??ａ）宏基因組文庫構(gòu)建??直接克隆環(huán)境ＤＮＡ的想法最早由Ｐａｃｅ在１９８５年提出，并于１９９１年被他的科研團(tuán)??隊?wèi)?yīng)用于海洋宏基因組１６Ｓ?ｒＲＮＡ基因的克�。郏福玻福常�。后來由ＤｅＬｏｎｇ和同事在１９９６年從??海洋水樣品構(gòu)建整個宏基因組ＤＮＡ的ｆｏｓｍｉｄ載體文庫而廣為人知［８４］。構(gòu)建宏基因組文??庫的需要對ＤＮＡ的片段濃度、大小和純度等信息進(jìn)行驗證。因為質(zhì)量差的ＤＮＡ可能??７??

ＣＵｎｉｑｕｅＴａｇｓ）數(shù)目是２４。野外馬廢糞便樣品的ＵｎｉｑｕｅＴａｇｓ有２條，而圈養(yǎng)馬廢類便??樣品的ＵｎｉｑｕｅＴａｇｓ有２２條，很明顯的是圈養(yǎng)組遠(yuǎn)大于野外組。沒有獲得注釋信息的??Ｔａｇｓ數(shù)目平均為０．６５，可見Ｔａｇｓ的注釋比例非常高，均大于９９．９％，具體見圖２－１。??Ｉ?Ｔｏｕｌ?４２９６２）?■?Ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ?Ｔａｇｓｉａｖｑ?１）?■?ＯＨＷａｖ＾?１０２７）??■?Ｔａｘｏｎ?Ｔｊ３ｓ＊．ａｖ９．３Ｓ４８２）?Ｕｎｉｑｕｅ?Ｔａｇｗａｖ＾?７４７９１??６００００－１?「１７Ｓ０??Ｉ?．?Ｉ?？?ｅ?ｔ?ｊ?：?？?，?ｌｉｓｏｏ??Ｉ；?：?！?ｆ?；ｉ?：＝?ｉ?，?；?；?ｉ?ｉ?ｉ??；－．ｕ?ｉＪ．ｉ?ｍｉ?ｉ?：?ｉ?ｉ?ｓ?；?ｋ?１?；?ｉｐｓｏ??Ｉ４００００?ｉ?Ｓ?，ｉ?？，?，?ｉ?，?ｆ?｝?．?ｉ．：ｉ?．?ｉ?ｉ?３??！?＝?■?ｉ?｜?：ｈ?；?■??ｚ?（?！?：?■?５?ｃ??！?！?Ｉ?！?：?｜?：?；?ｋ７Ｓ０?Ｉ??卜?２００００?＇??－Ｓ００??〇ｃ、°?ｃ、、＾?＃?Ｃ、ｖ。、Ｊ?ｅ?６?ｄ?ｄ?ｄ?／?／?／?／?／?／?／?夕?／?／?ｆ?／?／?／?＃?Ｐ?ｉ?ｉ?＃?妒。??Ｓａｍｐｌｅ?Ｎａｍｅ??圖２－１各樣品的ＯＴＵｓ聚類和注釋情況統(tǒng)計??Ｆｉｇｕｒｅ２－１?Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ?ａｎｄ?ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ?ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ?ａｂｏｕｔ?ＯＴＵｓ?ｆｏｒ?ｅａｃｈ?ｓａｍｐｌｅ??為了解各分類水平的整體注釋情況

?３５??Ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?ｓａｍｐｌｅｓ??圖２－３物種累積曲線??Ｆｉｇｕｒｅ２－３Ｓｐｅｃｉｅｓ?ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ?ｃｕｒｖｅ??１８??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2871074