番茄枯萎病是由鐮刀屬真菌番茄尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici,Fol)侵染引起,導(dǎo)致植物維管束組織枯萎、植株枯黃、球莖和根腐爛,造成植株生長(zhǎng)衰弱直至萎蔫枯死的一種世界性真菌土傳病害。植物small RNA(sRNA)是一類長(zhǎng)度大約為20-30堿基的具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能的非編碼RNA,通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因表達(dá),參與了植物對(duì)環(huán)境脅迫應(yīng)答等多種重要的生物學(xué)過(guò)程。在病原菌侵染條件下,許多相關(guān)的植物內(nèi)源sRNA的表達(dá)水平會(huì)受到影響,但Fol與番茄互作的具體分子機(jī)制尚不清楚。我們的前期研究表明,Fol侵染番茄抗病品系Motelle后,一些番茄內(nèi)源sRNA的表達(dá)水平發(fā)生變化,其中Sly-miR482e-3p的表達(dá)被抑制,其靶基因在Fol侵染后轉(zhuǎn)錄水平都相應(yīng)上升。在此基礎(chǔ)上,本研究(1)檢測(cè)了不同抗性品系番茄在Fol侵染條件下Sly-miR482e-3p的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Sly-miR482e-3p在病原菌侵染早期應(yīng)答;(2)不同組織表達(dá)結(jié)果表明Sly-miR482e-3p主要在番茄植株莖和葉中表達(dá),;(3)利用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù),在感病品種Moneymaker(MM)中敲除Sly-miR482e-3p,獲得轉(zhuǎn)基因純合植株Line2,Line5和Line6,測(cè)序結(jié)果表明這些轉(zhuǎn)基因植株分別在靶點(diǎn)1位置缺失2、9、6個(gè)堿基;(4)qRT-PCR結(jié)果表明Sly-miR482e-3p表達(dá)水平極顯著下降,且Sly-miR482e-3p的兩個(gè)NBS-LRR 靶基因的表達(dá)水平上升;(5)sly-miR482家族其他成員包括sly-miR482a、sly-miR482b、sly-miR482c、sly-miR482d-3p、sly-miR482d-5p 和 sly-miR482e-5p 的表達(dá)不受影響;(6)Fcol侵染條件下,抗性分析結(jié)果表明在感病品種Moneymaker中敲除Sly-miR482e-3p導(dǎo)致感病品系對(duì)病原菌Fol抗性增加,表明Sly-miR482e-3p參與了番茄抗枯萎病的過(guò)程;(7)為了進(jìn)一步探討Sly-miR482e-3p通過(guò)何種具體機(jī)制參與了番茄抗枯萎病的過(guò)程,我們構(gòu)建了 6個(gè)轉(zhuǎn)錄組(mRNA-seq)文庫(kù),MM_H2O、MM_Fol、Line2_H2O、Line2_Fol、Line5_H2O、Line5_Fol。(8)通過(guò)測(cè)序分析Fol侵染后不同材料在不同處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)和關(guān)鍵信號(hào)通路,結(jié)果表明在敲除Sly-miR482e-3p后植物激素乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受到調(diào)控,且乙烯合成以及信號(hào)通路因子相關(guān)基因差異表達(dá);(9)qRT-PCR結(jié)果表明,Sly-miR482e-3p敲除轉(zhuǎn)基因植株中乙烯合成酶基因LeACO1和LeACS3,乙烯信號(hào)通路正調(diào)控因子基因EIN2和EIL1,乙烯轉(zhuǎn)錄應(yīng)答效應(yīng)子基因LeERFl、LeERF4、LeERF5和LeERF9表達(dá)水平與野生型相比下調(diào);而乙烯通路負(fù)調(diào)控因子基因LeETR1、LeETR4、LeETR5、LeCTR2和LeCTR3表達(dá)水平在Fol侵染后與野生型相比上調(diào);(10)外源噴灑乙烯前體ACC導(dǎo)致抗病品種Motelle對(duì)Fol的侵染變得敏感,表明Sly-miR482e-3p可能通過(guò)介導(dǎo)乙烯信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制參與了番茄抗枯萎病過(guò)程。綜上所述,本研究表明Sly-miR482e-3p以負(fù)調(diào)控的方式介導(dǎo)乙烯信號(hào)通路的方式參與了番茄抗枯萎病的過(guò)程,揭示了 Sly-miR482e-3p在番茄與尖孢鐮刀菌的互作中的分子機(jī)理,同時(shí),為利用分子遺傳育種培育新的抗枯萎病品種提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S436.412.1
【部分圖文】：

比如鋅指核酸酶（ＺＦＮｓ）?［３７］［３８］，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（ＴＡＬＥＮｓ）［３９］以及ＲＮＡ??指導(dǎo)的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ核酸酶基因編輯技術(shù)＿４１］。其中，Ｃａｓ９是由�。遥危烈龑�(dǎo)核酸酶與靶??ＤＮＡ通過(guò)堿基配對(duì)（圖１），設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，特異性高，效率高且適合高水平的系統(tǒng)。尤其適用??于對(duì)各種細(xì)胞類型以及有機(jī)體的高通量且相對(duì)復(fù)雜的基因編輯［４２］［４３】。??

材料與方法??料以及供試菌株??宄采用兩個(gè)不同的番燕品系：抗病品系Ｍｏｔｅｌｌｅ?（Ｍｏｔ）和感病品系Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ植物病原菌為野生型番癡尖孢嫌刀菌（？ＦＨＯＴｒ／ｗｍｃｕ〔網(wǎng)圓ｆ．?ｓｐ．?？ＦＧＳＣ稱為ｆＷ４２８７或者＿仏３４９３６）。尖孢鐮刀菌接種在液體培養(yǎng)基中，２８°Ｃ，光蕩生長(zhǎng)４天待用。??幼苗在２５°Ｃ，１６／８－ｈ亮／暗循環(huán)條件下生長(zhǎng)兩周。從土壤中取出番茄幼苗，用流動(dòng)??沖洗根，然后在分生孢子濃度為ｌｘｌＯ８／?ｍ丨的凡／溶液中孵育３０分鐘。用水處苗作為對(duì)照。根據(jù)需要決定每種處理使用的幼苗數(shù)。然后將所有處理過(guò)的番茄含有蛭石的盆中，并置于２５°Ｃ的生長(zhǎng)室中２４小時(shí)（１６小時(shí)光照，８小時(shí)黑暗）??質(zhì)粒??究所采用的兩種構(gòu)建ＣＲＩＳＰＲ載體的質(zhì)粒ｐＨＳＥ４０１＿ｔｏｍａｔｏＵ６（?ｐＴＸ０４１）和ｐＣＢＣｔ〇ｍａｔ〇Ｕ６?（Ｐ４３）由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研宄所的李傳友課題組提供。??ＩＲＢ?Ｔ－ＤＮＡ?ｒｅｐｅａｔ；?１ＮＱＳ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ］??

法５．２檢測(cè)Ｓｌｙ－ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ的表達(dá)量。??通過(guò)ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)了?Ｆｏ／侵染后不同時(shí)間點(diǎn)的兩個(gè)番莉品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ和Ｍｏｔｅｌｌｅ的??Ｓｌｙ－ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ的表達(dá)水平，如圖１。該結(jié)果顯示，Ｆｏ／侵染后早期，隨著時(shí)間增加，Ｓｌｙ－??ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ在感病品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ中表達(dá)量上調(diào)，但在７２?ｈｐｉ略微下調(diào)；而在抗病品種??Ｍｏｔｅｌｌｅ中ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ表達(dá)量下調(diào)，同時(shí)在７２ｈｐｉ輕微上調(diào)，但是表達(dá)量明顯低于同處理下??的Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ中的表達(dá)量。??２?５????＿?ｗｍｍ?ＭＭ－Ｈ２Ｏ?ＭＭ－Ｆｏ／?Ｍｏｔ－Ｈ２〇?Ｍｏｔ－Ｆｏ／??—２．０?－?＾??Ｏｈ?１２ｈ?３６ｈ?７２ｈ??圖１尸〇／侵染后Ｓｌｙ?－ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ在Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ和Ｍｏｔｅｌｌｅ中的表達(dá)量。??三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差線代表ＳＤ。字母表示顯著差異（單因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）?；Ｐ??＜０．０５）〇??２?Ｓｌｙ－ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ組織特異性表達(dá)??ＭｉｃｒｏＲＮＡ在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著非常重要的作用。然而，由于不同的調(diào)控方法，不??同的ＭｉｃｒｏＲＮＡ在植物不同組織中的表達(dá)量也不同。ＭｉｃｒｏＲＮＡ具有細(xì)胞特異性和組織特異??性表達(dá)的特征［１３５］。研究表明，大豆的ｍｉＲ４８２在大豆的所有組織中都有表達(dá)，但它有組織特??異性，在莖中表達(dá)最高，其次是花，最后是葉和根［１３６］。本研宄中應(yīng)答尖孢鐮刀菌侵染的??ｍｉＲ４８２家族的Ｓｌｙ－ｍｉＲ４８２ｅ－３ｐ是否具有組織表達(dá)特異性還沒有報(bào)道
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本文編號(hào)：2871449