柑橘是世界上種植最廣泛的水果之一,中國是主要的柑橘生產(chǎn)國,面積和產(chǎn)量均居世界第一。柑橘鱗皮病毒(Citrus psorosis virus,CPsV)引起的柑橘鱗皮病是一種世界性分布的病毒類病害,主要通過嫁接進(jìn)行傳播。CPsV是蛇形病毒屬典型的種,是三分體負(fù)單鏈RNA病毒。CPsV具有兩種類型鱗皮病A和鱗皮病B,其中鱗皮病A比較常見,其引起的典型癥狀為:嫩葉葉脈間出現(xiàn)褪綠斑紋,主干樹皮出現(xiàn)鱗片狀開裂;鱗皮病B會引起更嚴(yán)重的癥狀,嫩葉出現(xiàn)橡形葉癥狀,老葉出現(xiàn)環(huán)斑癥狀,主干和嫰枝出現(xiàn)鱗片狀開裂,但是感染鱗皮病A的柑橘植株可以保護(hù)植株在次感染鱗皮病B時,不出現(xiàn)鱗皮病B的癥狀。目前已經(jīng)公布了一組CPsV的基因組序列,為西班牙的P-121株系。本研究根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中CPsV外殼蛋白(Coat protein,CP)的基因序列設(shè)計了4組特異性檢測引物,通過一系列反應(yīng)條件的優(yōu)化,篩選并獲得1組特異性的檢測引物。以感染CPsV的柑橘葉片總RNA為模板,采用一步法RT-LAMP(One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification),在60℃下反應(yīng)60 min,擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖電泳分析,同時對其特異性和靈敏度進(jìn)行測定。結(jié)果表明,建立的RT-LAMP檢測體系能特異性擴(kuò)增CPsV,靈敏度為RT-PCR的10倍。用建立的RT-LAMP方法對258個田間樣品進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)5個樣品感染了CPsV,其檢測結(jié)果與RT-PCR法一致。RT-LAMP法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單、反應(yīng)快速等特點,適合對CPsV樣品的快速檢測與鑒定。運用轉(zhuǎn)錄組測序、RT-PCR和RACE驗證,獲得了CPsV的5個分離物CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21的全基因組。序列分析結(jié)果表明,CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21的基因組全長大小分別為11282 nt、11279nt、11278 nt、11283 nt和11305 nt,均包含4個開放閱讀框。CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21之間的MP基因的核苷酸相似性為80.78%~99.37%,編碼氨基酸相似性為90.55%~99.16%;與國外CPsV分離物的MP基因核苷酸序列相似性為80.78%~99.79%,其對應(yīng)氨基酸序列相似性為89.71%~99.58%。CHN-1、CHN-2、CHN-3、CHN-HN和CHN-UN21之間的CP基因的核苷酸相似性為81.44%~99.02%,編碼的氨基酸相似性為88.38%~99.32%;與國外CPsV分離物的CP基因核苷酸序列相似性為81.29%~100.00%,其對應(yīng)氨基酸序列相似性為88.38%~100.00%�；贛P基因和CP基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示CHN-1、CHN-2、CHN-3和CHN-HN聚為一簇,CHN-UN21單獨聚為一簇。通過序列分析發(fā)現(xiàn)CHN-3和CHN-UN21的序列存在較大差異,由于沒有CHN-3和CHN-UN21單獨侵染的柑橘苗木,為了驗證二者是不是在癥狀上也存在差異,將CHN-3和CHN-UN21的MP基因24 k基因克隆至表達(dá)載體TRV中,侵染本氏煙觀察癥狀差異。結(jié)果表明,二者在本氏煙上的侵染癥狀相似,均表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)輕微皺縮癥狀。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S436.661.1
【部分圖文】：

圖 1.1 蛇形病毒屬包含病毒的病毒粒子形態(tài)（A）和基因組結(jié)構(gòu)（B）Fig. 1.1 Virion morphology (A) and genomic structure (B) of the genus Ophiovirus1.1.2 CPsV 的發(fā)現(xiàn)與發(fā)生由 CPsV 引起的柑橘鱗皮病是一種古老的柑橘病害。19 世紀(jì) 90 年代，在佛羅里達(dá)州和加利福尼亞首次觀察到老葉呈現(xiàn)斑駁黃化癥狀、樹皮呈鱗片狀開裂，在當(dāng)時并不清楚引起該癥狀的病因。1933 年，F(xiàn)awcett 發(fā)現(xiàn)引起柑橘樹嫩葉花葉以及[16-18]

第 1 章 文獻(xiàn)綜述病 B（psorosis B，PsB）[30]。PsA 是比較常見的 CPsV 感病類型，主要危害寬皮柑橘（Citrus reticulata）、葡萄柚（Citrus paradisi Macf）和甜橙（Citrus sinensis (L.) Osbeck）等敏感寄主，可引起樹木主干枝條呈鱗片狀開裂，樹木主干流膠位點凹陷，并且樹杈部位的木質(zhì)發(fā)生變色（圖 1.2b），田間感病植株的春梢、秋梢常出現(xiàn)枯萎（圖 1.2d）以及葉脈間褪綠黃化及斑駁癥狀（圖 1.2e）。酸橙和檸檬等耐感品種，感染后會表現(xiàn)出典型的葉片癥狀，而不會出現(xiàn)樹皮開裂癥狀[31, 32]。PsB 會引起比 PsA 更加嚴(yán)重的癥狀，感病植株會出現(xiàn)嫰枝充膠現(xiàn)象，樹皮大面積呈鱗皮狀開裂（圖 1.2a），嫩葉上出現(xiàn)橡形葉癥狀（圖 1.2f），老葉上出現(xiàn)明顯的環(huán)斑以及壞死癥狀（圖 1.2g）），同時葉背面出現(xiàn)粘性膿皰（圖 1.2h），果實上也會出現(xiàn)明顯的環(huán)斑以及半環(huán)斑現(xiàn)象（圖 1.2c）[32-34]。但是 PsB 田間發(fā)生率較低。

圖 1.3 科西嘉島上寬皮桔樹干去皮前后的柑橘瞎膠病的凹陷癥狀（A、B）、科西嘉島橙作砧木的寬皮桔樹的柑橘囊膠病的凹陷癥狀（C、D、G）和接種柑橘雞冠皮病的酸橙樹的凹陷癥狀（E、F、H）Fig. 1.3 Bind pocket symptoms on mandarin trunk before and after bark remoral, Corsica. (A, Mandarin trees on sour orange with concave gum symptoms on scion, Corsica. (C, D, G);Cristacortis stem pitting on inoculated sour orange seedling trees. (E, F, H)1.4.5 柑橘石果病柑橘石果病由感染該病害的果實像石頭一樣堅硬而得名。該病首先在巴基被描述為生理性病害[53]。柑橘石果病在地中海地區(qū)比較流行[54]，伊朗和委內(nèi)[55]已證實了該病的存在。感病的柑橘樹葉片會出現(xiàn)環(huán)斑和橡形葉癥狀，同時異常的果實下落，以及果皮變硬并伴隨皮下沖膠現(xiàn)象（圖 1.4）[56]。Ruggier柑橘石果病可進(jìn)行嫁接傳播[57]。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2871022