飛蝗(Locusta migratoria)屬于昆蟲綱,直翅目,蝗科,由于其具有較強(qiáng)的遷飛和跳躍能力,因此其分布范圍極廣,涉及歐亞大陸和大洋洲以及我國華北和華東沿海各省。飛蝗主要危害小麥、玉米、高粱、水稻等經(jīng)濟(jì)作物,是一種極具破壞力的農(nóng)業(yè)害蟲,嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、影響人民的正常生活。飛蝗是一種漸變態(tài)昆蟲,昆蟲的變態(tài)發(fā)育是伴隨著蛻皮發(fā)生的,昆蟲正常的蛻皮對于其整個生命周期至關(guān)重要。昆蟲蛻皮受到蛻皮激素(20-Hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(Juvenile hormone,JH)的調(diào)節(jié),而激素是通過下游的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的,其中主要是核受體因子(nuclear receptor,NR)。核受體因子是一個龐大的家族,廣泛參與昆蟲的蛻皮、生殖、免疫以及形態(tài)建成等過程,因此核受體因子歷來是研究熱點(diǎn),同時核受體因子也是害蟲防治新的潛在靶標(biāo)。本文基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫獲得兩個核受體因子:HR3和βFTZ-F1,并探討其在飛蝗表皮和翅發(fā)育中的作用,主要研究結(jié)果如下:1.HR3和βFTZ-F1序列和表達(dá)特性基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫,克隆獲得LmHR3和LmβFTZ-F1 cDNA序列,其長度分別為1626 bp和2196 bp,分別編碼455和731個氨基酸,均具有典型的核受體保守結(jié)構(gòu)域:DBD(DNA Binding Domain)和LBD(Ligand Binding Domain);聚類分析結(jié)果顯示二者分別與蜚蠊目的昆蟲聚為一支;飛蝗5齡若蟲不同組織和時期表達(dá)結(jié)果顯示:LmHR3在測試組織部位均有表達(dá),其中在表皮中的表達(dá)量最高,發(fā)育時期表達(dá)顯示,其在第6天表達(dá)到達(dá)峰值;而LmβFTZ-F1在各組織均高表達(dá),但時期表達(dá)顯示其在第7天達(dá)到峰值。二者時期表達(dá)模式與20E滴度具有一致性,二者均在蛻皮前高表達(dá),暗示其可能受20E誘導(dǎo)。隨后,體內(nèi)20E誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和沉默掉20E受體基因EcR兩個實(shí)驗(yàn)結(jié)果,均可表明其受到20E正調(diào)控作用。2.LmHR3在飛蝗蛻皮中的功能分析為了探討LmHR3在飛蝗蛻皮中的功能,首先利用RNA干擾方法向5齡第2天若蟲體內(nèi)注射10μg LmHR3的dsRNA(dsLmHR3),以注射等量的綠色熒光蛋白基因GFP的dsRNA(ds GFP)為對照,正常飼養(yǎng)觀察表型。結(jié)果顯示,沉默LmHR3的表達(dá)后5齡若蟲全部無法出現(xiàn)蛻皮表型而死亡。HE和幾丁質(zhì)染色結(jié)果顯示,與對照組相比,處理組若蟲表皮能夠發(fā)生皮層溶離,但新表皮層顯著變薄;透射電鏡結(jié)果顯示,新表皮幾乎無法正常形成,舊表皮無法降解。RT-qPCR檢測幾丁質(zhì)代謝相關(guān)基因發(fā)現(xiàn),與對照組相比,幾丁質(zhì)合成(LmUAP1和LmCHS1)和降解(LmCht5和LmCht10)基因的表達(dá)均顯著降低,表明LmHR3通過調(diào)控幾丁質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)控制若蟲向成蟲的轉(zhuǎn)變。為了進(jìn)一步探討LmHR3在若蟲至若蟲間蛻皮中的作用,利用同樣方法在飛蝗早期若蟲(3齡和4齡)中沉默掉LmHR3均導(dǎo)致飛蝗無法正常蛻皮,最終導(dǎo)致死亡;類似于5齡若蟲至成蟲,早期若蟲幾丁質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)在處理組中均出現(xiàn)顯著下調(diào)。綜上所述LmHR3可通過調(diào)控幾丁質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)來控制飛蝗若蟲至若蟲和若蟲至成蟲的蛻皮。3.LmβFTZ-F1在飛蝗蛻皮中的功能分析利用上述RNA干擾方法,向5齡若蟲體腔注射LmβFTZ-F1的dsRNA沉默其表達(dá),結(jié)果顯示,與對照組相比,處理組5齡飛蝗若蟲出現(xiàn)一定程度的延遲發(fā)育,盡管最終能出現(xiàn)蛻皮變?yōu)槌上x,但成蟲出現(xiàn)身體褶皺,翅型卷曲;通過HE染色觀察對照組和處理組5齡若蟲翅芽的發(fā)育情況,結(jié)果顯示處理組翅芽皮層溶離延遲;透射電鏡結(jié)果顯示處理組成蟲表皮和前翅均可發(fā)現(xiàn)真皮細(xì)胞層中細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞。同理,在早期若蟲(4齡蟲)沉默LmβFTZ-F1的表達(dá),發(fā)育至成蟲后出現(xiàn)與干涉5齡時期若蟲類似的表型。為了探討LmβFTZ-F1在飛蝗蛻皮中的作用機(jī)制,我們在5齡第2天飛蝗若蟲沉默LmβFTZ-F1表達(dá),48 h后剪取對照組和處理組飛蝗的翅芽提取總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果共獲得19142條Unigenes,177個差異表達(dá)基因,其中96個呈上調(diào),81個呈下調(diào);進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)代謝相關(guān)基因、翅特異表達(dá)的表皮蛋白基因和羧肽酶代謝相關(guān)基因(與皮層溶離相關(guān))具有表達(dá)差異性;RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,羧肽酶代謝相關(guān)基因表達(dá)與對照組相比顯著下調(diào),推測LmβFTZ-F1可能參與調(diào)控羧肽酶代謝相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而控制飛蝗皮層溶離的發(fā)生。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S433.2
【部分圖文】：

1圖 1.1 昆蟲表皮和翅的結(jié)構(gòu)[1, 2]Epicuticle：上表皮，Exocuticle：外表皮，Endocuticle：內(nèi)表皮，Procuticle：原表皮，Epidermal cells：真皮細(xì)胞

分子量約為 51 kDa，LmβFTZ-F1 的理論等電點(diǎn) pI 是 6.25，分子量約 79 kDa。LmHR3 含有 10 個外顯子（圖2.1A），結(jié)構(gòu)預(yù)測分析顯示 LmHR3 含有一個配體結(jié)合域 LBD 和一個鋅指結(jié)構(gòu)的 DNA結(jié)合域 DBD（圖 2.1B）；系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示 LmHR3 與蜚蠊目濕木白蟻和德國小蠊聚在一支（圖 2.1C），LmHR3 氨基酸序列與其他昆蟲的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn) LBD

圖 2.1 飛蝗的 LmHR3 的生物信息學(xué)分析A：顯示 LmHR3 的基因結(jié)構(gòu)圖，LmHR3 大致的基因長度，Exon 表示外顯子，綠色豎線表示；Intron表示內(nèi)含子，黑色橫線表示。B：顯示不同物種的 HR3 含有的結(jié)構(gòu)域，黃色橢圓表示 DBD（Zn-FC4），綠色六邊形表示 LBD（HOLI），Lm 表示飛蝗、Aa 表示埃及伊蚊、Dm 表示果蠅、Bg 表示德國小蠊，aa=氨基酸。C：采用鄰接法與不同物種的聚類分析，Bootstrap 值為 1000，從上往下為 Blattaria蜚蠊目，Orthoptera 直翅目，Hymenoptera 膜翅目，hemiptera 半翅目，Coleoptera 鞘翅目，Diplostraca 雙甲目，Diptera 雙翅目
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本文編號：2870748