本研究通過透射電鏡觀察、小RNA深度測序技術(shù)和RT-PCR擴增技術(shù)對遼寧三種木本植物樣品中病毒進行了鑒定。確定侵染桃葉衛(wèi)矛的病毒為甲型線性病毒科(Alphaflexiviridae)馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)中的一個新病毒;確定侵染黃檗的病毒為馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)里新建立的玫瑰黃花葉病毒屬(Roymovirus)的新病毒;確定侵染丁香的病毒為乙型線性病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)中水蠟A病毒(ligustrum virus A,LVA)的遼寧分離物。本研究豐富了可感染木本植物的病毒資源,為防治木本植物病毒病奠定了理論基礎(chǔ)。(1)2016年8月,在遼寧沈陽采集到患有黃脈癥狀的桃葉衛(wèi)矛葉片,使用透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察到750×13nm病毒粒子。通過小RNA深度測序和RT-PCR分子克隆技術(shù),在樣品中擴增到一種Potexvirus屬病毒。該病毒的基因組由7,279個核苷酸組成,并含有5個開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)�；谕鈿さ鞍�(Coat protein,CP)基因的核苷酸和氨基酸序列,該病毒與白三葉草花葉病毒(White clover mosaic virus,WCMV,X16636)(40.1%)和三葉草黃花葉病毒(Clover yellow mosaic virus,ClYMV,D00485)(37.1%)具有40%左右的同源性。系統(tǒng)發(fā)育分析表明該病毒與Potexvirus屬中的草莓輕型黃邊病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)的同源性最高,在系統(tǒng)發(fā)育樹中在同一分支上。上述分析表明,該病毒是甲型線性病毒科(Alphaflexiviridae)馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)中的一個新病毒,將其命名為衛(wèi)矛黃脈伴隨病毒(Euonymus yellow vein associated virus,EuYVAV)。這是第一次桃葉衛(wèi)矛植物感染馬鈴薯X病毒的報道。(2)2017年10月,在遼寧沈陽60年樹齡的木本植物黃檗(Phellodendron amurense Rupr.)的黃環(huán)斑病葉中觀察到彎曲的線性病毒粒子(1000×13nm)。使用小RNA深度測序和RT-PCR分子克隆技術(shù),從病葉中擴增到一種馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的病毒。該病毒的完整基因組序列由10,457個核苷酸組成,并且包含一種典型的馬鈴薯Y病毒科的多聚蛋白(Polyprotein)。經(jīng)鑒定該病毒與馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)里新建立的玫瑰黃花葉病毒屬(Roymovirus)中的玫瑰黃花葉病毒(Rose yellow mosaic virus,RoYMV,NC_019031)的同源性最高,并且在基于完整多聚蛋白和外殼蛋白基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中與RoYMV在同一分支上。該病毒的cp基因與RoYMV的核苷酸和氨基酸的同源性分別為49.2%和55.1%,表明該病毒是Potyviridae科的新成員,被命名為黃檗黃環(huán)斑伴隨病毒(Phellodendron yellow ringspot-associated virus,PYRAV)。這是國內(nèi)外首次病毒感染黃檗植物的報告。(3)2016年6月,在遼寧省沈陽市采集的表現(xiàn)為黃脈針葉癥狀的丁香樣品中觀察到彎曲的線性病毒粒子(580×13nm)。使用小RNA深度測序和RT-PCR分子克隆技術(shù)從病葉中擴增到一種乙型線性病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)病毒。該病毒的完整序列大小為8,525nt,并編碼六種典型的Carlavirus蛋白。基于該病毒的基因組序列進行同源性分析,發(fā)現(xiàn)該病毒與水蠟A病毒的韓國分離物(Ligustrum virus A,LVA)的同源性最高,為73.2%,并且在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹時與LVA在同一分支上�；趶�(fù)制酶蛋白(ReP)和外殼蛋白(CP)基因,該病毒與LVA的核苷酸序列的同源性分為72.2%和74.9%,氨基酸序列同源性分別為81.4%和86.1%。由此,可以斷定該病毒是LVA的分離物。這是首次LVA天然感染丁香植物的報道。
【學(xué)位單位】：沈陽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S432.41
【部分圖文】：

無包膜的線性病毒粒子（470-580×13nm組。基因組 RNA 含有 5'-帽子結(jié)構(gòu)和 3'- RNA 聚合酶（RdRp），三種基因（TG5]。雖然近年來已報道了大量的 Potexvir[66-82]。本實驗報道了一種能夠侵染木本毒。 月采集的桃葉衛(wèi)矛（Euonymus bungean存于本實驗室（圖 2.1）。

圖 2.2 RT-PCR 擴增桃葉衛(wèi)矛上 EuYVAV 基因組全長引物設(shè)計圖Figure 2.2 The design of EuYVAV RT-PCR primer genome cDNA clone on Euonymus bungeanusMaxim2.3 實驗方法2.3.1 病毒電鏡觀察取新鮮的典型花葉癥狀葉片，置于研缽中，加入 10% PBS 緩沖液至剛好沒過葉片，研磨，將樣品研磨成勻漿狀，置于 1.5ml Eppendorf 管中，室溫下5000rpm-6000rpm 離心 3min。吸取液體另放于新管中，取植物病毒粗提液 20μl，2%磷鎢酸 50μl 于表面皿上，首先將銅網(wǎng)置于粗提液上表面，為了使樣品汁液附著于銅網(wǎng)中，將銅網(wǎng)放入其中漂染 3min，染色 10s，濾紙吸干液體，放置于表面皿中備用；將樣品置于透射電鏡下（Hitachi TEM system）觀察（觀察實驗

菊 B 病毒 Chrysanthemum vi楊樹花葉病毒 Poplar mosaic vi蘋果莖痘病毒 Apple stem pitting 湖北甲型線性病毒 Hubei alphaflexi-lik分析葉樣品電鏡觀察結(jié)果衛(wèi)矛病葉于透射電鏡下進行病毒粒子的負(fù)性粒子，病毒粒子外表面無包膜（圖 2.3
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2869858