本文研究了亞洲玉米螟Ostria furnacalis(Guenee)幼蟲體內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)的功能,進一步探究了 Bt 毒蛋白 Cry1Ab 對亞洲玉米螟MAPK基因及其他免疫和應(yīng)激相關(guān)基因的調(diào)控機制。采用RACE方法克隆獲得了亞洲玉米螟MAPK基因的cDNA全長序列,對MAPK基因序列進行了生物信息學分析,成功完成MAPK蛋白的可溶原核表達,利用Western blotting驗證了目標蛋白,并制備了多克隆抗體,初步進行了 MAPK蛋白的細胞及組織定位。利用亞致死劑量LC30的Bt毒蛋白Cry1Ab喂飼處理了亞洲玉米螟4齡幼蟲,利用qRT-PCR技術(shù)分析了亞致死劑量Cry 1 Ab-LC30處理對MAPK基因以及其他相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響;RNAi技術(shù)抑制MAPK基因表達后利用qRT-PCR技術(shù)分析MAPK及其他相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響;利用亞致死劑量的Cry1Ab-LC30處理亞洲玉米螟4齡幼蟲后并對MAP基因進行RNA干擾,分析了MAPK基因及其他相關(guān)基因信號通路的調(diào)控機制,主要研究結(jié)果如下:(1)利用RACE技術(shù)克隆并獲得了亞洲玉米螟體內(nèi)MAPK基因全長cDNA序列。序列全長1592bp,開放閱讀框(ORF)長度約1095 bp,ATG為起始密碼子,TAA為終止密碼子,編碼364個氨基酸,包括一個65 bp的5'非編碼區(qū)和一個432 bp的3'非編碼區(qū)(GenBank登錄號為:MF797866)。Of-MAPK的計算分子量約為41.9kDa。在22-355位含有一個S TKC保守結(jié)構(gòu)域,對Of-MAPK進行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測后發(fā)現(xiàn)具有13個α螺旋,8個β折疊。Of-MAPK的氨基酸序列與二化螟Chilo suppressalis ERK2、臍橙螟蛾Amyelois transtella MAPK、海波斯莫科馬屬蛾Hyposmocoma kahamanoa MAPK、大蠟螟 Galleria mellonella MAPK、柑橘鳳蝶Papilio xuthus MAPK、棉鈴蟲Helicoverpa armigera MAPK 高度同源。(2)采用pET-28a表達系統(tǒng)對MAPK基因編碼的蛋白進行了原核表達,結(jié)果表明:Of-MAPK重組蛋白的分子量大小與預(yù)測結(jié)果一致,約為41 kDa。pET-28a-Of-MAPK在28℃、0.2 mMIPTG誘導條件下上清中可大量表達MAPK蛋白,并進行了 Western blotting鑒定。多克隆抗體制備完成后,通過FITC標記可明顯在血細胞上觀察到MAPK蛋白的分布,利用免疫電鏡可在幼蟲體壁組織中觀察到MAPK蛋白顆粒的分布。(3)亞致死濃度Cry1Ab-LC30處理亞洲玉米螟4齡幼蟲后,通過qRT-PCR檢測了不同時間MAPK及其他相關(guān)基因(AKHR、PPO、GSH-Px、Cat及Hsp90)mRNA水平上的表達變化情況;將MAPK成功RNAi后檢測了 MAPK及其他相關(guān)基因mRNA水平上的表達變化情況;亞致死濃度Cry1Ab-LC30處理后再將MAP RNAi,并檢測MAPK及其他相關(guān)基因mRNA水平上的表達變化情況。結(jié)果表明:Of-MAPK以及Of-Hsp90基因在表達水平上均顯著提高;AHK及GSH-Px處理早期會受到影響而顯著升高;PPO及Cat表達會受到抑制。亞洲玉米螟4齡幼蟲注射MAPK-dsRNA后,MAPK基因表達從12 h至72 h均有明顯下調(diào)。當MAPK基因被沉默后,AKHR基因表達水平上調(diào),PPO基因在0-48h內(nèi)下調(diào),隨后表達水平升高,GSH-Px以及Cat基因表達在12-24 h受到抑制,隨后顯著上調(diào),而Hsp90基因表達則表現(xiàn)出受到持續(xù)抑制的效果。將亞洲玉米螟4齡幼蟲喂飼活化后的Cry1Ab-LC30后再進行M4PK基因的RNAi,結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期MAPK基因與這些基因之間存在一定的相互關(guān)聯(lián),MAPK基因正調(diào)控PPO、Hsp90、GSH-Px及Cat基因,而MAPK基因負調(diào)控AHKR基因。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S435.132
【部分圖文】：

取保存的總ＲＮＡ約２?｜ｉｇ至２００卟ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ滅菌ＰＣＲ管中，然后加入ｄＮＴＰ?Ｍｉｘｔｕｒｅ??（１０?ｍＭ?ｅａｃｈ）?１?ｐＬ，０．５?ｊｉＭ?Ｏｌｉｇｏ?（ｄＴ）?ｐｒｉｍｅｒ?１?｜〇Ｌ，用?ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ?ｄｄＨ２〇?補足至?１０?）ｉＬ，??用槍頭混合后，將樣品置于６５°Ｃ條件下變性５?ｍｉｎ，放入冰盒中低溫冷卻ｌＯｍｉｎ。接著按??次序?qū)⑾铝性噭┘尤肷鲜龇磻?yīng)液中：５＞＜ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ?Ｂｕｆｆｅｒ?４?（ｉＬ，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ?ＲＮａｓｅ??（２００Ｕ／ｊａＬ）?１｜ｊＬ，ＲＮａｓｅ?Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?（４０Ｕ／（ａＬ）?０．５?｜ａｌ，用?ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅｄＨ２〇?補足至?２０?ｐＬ。??將混合物緩慢用槍頭混勻，離心后置于４２°Ｃ條件下溫育６０?ｍｉｎ，然后升溫至７０°Ｃ并持續(xù)??１５ｍｉｎ，即可完成ｃＤＮＡ合成。??２．５?基因的?３’－ＲＡＣＥ??２．５．１引物設(shè)計??基因中間片段引物設(shè)計參照其他鱗翅目昆蟲脫４／嘆基因的序列進行，擴增??得到的片段確認無誤后，在己知亞洲玉米螟中間片段序列設(shè)計３’ＲＡＣＥ引物，反應(yīng)擴增的??原理如下（圖１），擴增３＇ＲＡＣＥ目的片段的特異性引物設(shè)計見表１。??Ｋｎｏｗｎ?ｓｅｕｅｎｃｅ

末端快速擴增，通過兩對不同引物擴增得到的３＇－ＲＡＣＥ產(chǎn)物長度均約為６００?ｂｐ?（圖３）。??將目標條帶分別進行割膠回收，連接Ｔ載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，篩選搖菌，抽取質(zhì)粒送測??序。５＇－ＲＡＣＥ通過引物擴增得到３條條帶，３條長度約符合預(yù)期大小，分別割膠回收（圖４），??單克隆挑斑鑒定送測序（３條帶測序后鑒定均為但完整度較高）。??ｂｐ?Ｍ?１?２??２０００??？－??１０００??Ｅ?，?＂?■＇??７５０?——??丨歲緩邊錄攀’?＾?：?：：＾?Ｏ／－ＭＡＰＫ??５００????２５０??圖３?６？／－Ｍ４Ｐ＾基因３＇ＲＡＣＥ第一輪和第二輪的擴增產(chǎn)物??注：Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；泳道丨：３＇－ＲＡＣＥ?第一輪?ＰＣＲ?擴增產(chǎn)物；泳道?２：?３＇－ＲＡＣＥ?第二輪?ＰＣＲ??擴增產(chǎn)物??

３．１．２?ｑ／ＵＰ／ｉｒ基因全長ｃＤＮＡ序歹ＩＪ的克隆??根據(jù)３＇－ＲＡＣＥ和５＇－ＲＡＣＥ克隆獲得部分序列，拼接后設(shè)計基因全長克隆的引物，進行??的全長克隆實驗，得到１５００?ｂｐ左右的擴增產(chǎn)物（圖５），通過測序確定０／－Ｍ４／３／：??基因的全長核苷酸序列為１５９２?ｂｐ。??ｂｐ?Ｍ?１??２０００?￣????Ｑ／１ＭＡＰＫ??１０００?■??７５０???５００???２５０???１００???圖５?０／－Ｍ４／Ｖｆ全長ｃＤＮＡ擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果??注：Ｍ：?ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｋｅｒ；泳道１：全長ＰＣＲ擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果??
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本文編號：2869837