發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 04:42

　　 昆蟲是生物中種類數(shù)量最為龐大的類群。相較于其它高等動(dòng)物,昆蟲雖然身體相對(duì)較小,但繁殖能力強(qiáng),而且胚胎發(fā)育更為簡單,時(shí)序也相對(duì)較短。在昆蟲的胚胎發(fā)育過程中,涉及了羊膜、漿膜、卵黃囊這三種重要的胚胎外膜的形成、移動(dòng)、退化。不同的昆蟲中胚胎外膜的區(qū)別是很大的。研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有的昆蟲在胚帶形成后都會(huì)形成一個(gè)漿膜。在胚胎發(fā)育早期,由漿膜細(xì)胞分泌的附著于卵殼內(nèi)側(cè)的漿膜表皮,加強(qiáng)了卵殼對(duì)胚胎的保護(hù)作用,尤其是大大提高了卵的抗干燥能力。在大多數(shù)昆蟲中,到了胚胎發(fā)育后期,還會(huì)形成胚胎表皮,但在不同的昆蟲中,胚胎表皮的形成次數(shù)是有區(qū)別的。目前對(duì)于昆蟲漿膜表皮組分和相關(guān)基因研究很少。褐飛虱(Nilaparvata lugens),隸屬于半翅目,飛虱科,是水稻上的一種重要害蟲,由于其繁殖能力強(qiáng),極易暴發(fā)成災(zāi)。但褐飛虱是不是存在漿膜表皮和胚胎表皮還不清楚,對(duì)于漿膜表皮組分編碼基因更是一無所知。本研究首先對(duì)褐飛虱胚胎發(fā)育過程中漿膜表皮和胚胎表皮形成進(jìn)行了觀測,然后通過卵殼蛋白質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定,轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR),雙鏈RNA干擾(RNAi),透射電鏡(TEM)觀察,蛋白免疫印跡(Western blotting)等技術(shù)手段,對(duì)褐飛虱的漿膜表皮相關(guān)蛋白進(jìn)行了研究,此外還新鑒定了褐飛虱正常表皮形成所需的2種表皮相關(guān)蛋白。主要結(jié)果如下:1.胚胎期皮層的觀察。通過對(duì)不同時(shí)期卵的TEM觀察,發(fā)現(xiàn)褐飛虱在胚胎發(fā)育的早期會(huì)形成漿膜表皮,并在胚胎發(fā)育后期部分降解,同時(shí)觀察到了褐飛虱在胚胎發(fā)育的后期會(huì)形成一次胚胎表皮。漿膜表皮和胚胎表皮都含有幾丁質(zhì),形成片層結(jié)構(gòu)。2.漿膜表皮相關(guān)蛋白及其編碼基因的鑒定和功能研究。我們收集了產(chǎn)下72h卵的卵殼蛋白樣品,使用UPLC-MS/MS分析了該樣品的蛋白成分,與產(chǎn)下Oh卵的卵殼和若蟲孵出后留下的卵殼的蛋白質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行比較,共獲得了 47個(gè)蛋白同時(shí)存在于72h卵殼和若蟲孵出后留下的卵殼的蛋白樣品中但不存在于0h的卵殼蛋白樣品中,其中共有25個(gè)蛋白可信度較高。結(jié)合表達(dá)譜數(shù)據(jù),我們從這25個(gè)蛋白的編碼基因中選取了 13個(gè)在卵期0-72h特異性表達(dá)或高表達(dá)的基因,推測這些蛋白很可能是漿膜表皮相關(guān)蛋白。其中有3個(gè)蛋白都是屬于CPR家族的表皮結(jié)構(gòu)蛋白(NlugCpr3和NlugCpr2實(shí)驗(yàn)室已有報(bào)道;NlugCpr97是新發(fā)現(xiàn)的蛋白)。我們首先針對(duì)余下的10個(gè)蛋白編碼基因進(jìn)行了功能分析。我們對(duì)這10個(gè)基因暫時(shí)命名為Nlscrp110。研究發(fā)現(xiàn)有3個(gè)基因(Nlscrp2,Nlscrp4,Nlscrp5)對(duì)漿膜表皮正常形成是必需的,有5個(gè)基因(Nlscrp2,Nlscrp4,Nlscrp5,Nlscrp7,Nlscrp10)被干擾后影響了卵的孵化率。3.漿膜表皮中的6種幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白分析。通過表達(dá)譜分析,發(fā)現(xiàn)有6個(gè)屬于CPR家族的表皮蛋白,在胚胎發(fā)育的早期大量或特異表達(dá),其中有3個(gè)蛋白(NlugCpr2和NlugCpr3,NlugCpr97)在上述漿膜表皮質(zhì)譜分析主也被檢測到。實(shí)驗(yàn)室已有研究表明對(duì)其中5個(gè)基因(NlugCpr1,NlugCpr2,NlugCpr3,NlugCpr8,NlugCpr90)單獨(dú)進(jìn)行RNAi,除了NlugCpr2外,其他4個(gè)基因被干擾后對(duì)孵化率均產(chǎn)生顯著下降的影響。本研究對(duì)新發(fā)現(xiàn)的NlugCpr97單獨(dú)的進(jìn)行了 RNAi,并對(duì)其他5個(gè)已被單獨(dú)研究過的基因又進(jìn)行了聯(lián)合干擾分析。結(jié)果表明NlugCpr97被干擾后,對(duì)卵的孵化率沒有造成影響,胚胎可以正常發(fā)育。對(duì)其它五個(gè)基因聯(lián)合干擾后不僅影響漿膜表皮的正常形成,卵孵化率更是低至5.16%,比任一基因單獨(dú)干擾的33.95-75.87%孵化率低很多,表明不同CPR基因?qū)β逊趸视绊懹携B加效應(yīng),基因之間或許還存在著一定的功能互補(bǔ)。4.幾丁質(zhì)合成酶和多巴脫羧酶在漿膜表皮形成中的作用。表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)合成酶基因(CHS1)從胚胎發(fā)育期到1齡初期有3個(gè)表達(dá)高峰,分別對(duì)應(yīng)漿膜表皮、胚胎表皮和1齡若蟲表皮的形成時(shí)期。在初羽化雌蟲中對(duì)CHS1進(jìn)行RNAi,漿膜表皮完全不能形成,表明CHS1對(duì)胚胎早期的漿膜表皮的形成不可缺少。多巴脫羧酶(DDC)是一類磷酸吡哆醛酶類,可以將L-多巴轉(zhuǎn)化為多巴胺,對(duì)褐飛虱初羽化雌蟲中的多巴脫羧酶(Nlddc)進(jìn)行RNAi,漿膜表皮也不能形成,推測其對(duì)漿膜表皮的形成也是不可缺少的。5.一種新的表皮蛋白NICP21.92的鑒定。通過對(duì)褐飛虱組織轉(zhuǎn)錄組的分析,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在體壁上高表達(dá)的基因NlCP21.92,RT-qPCR和Western blotting分析顯示該蛋白隨著若蟲的蛻皮存在周期性的表達(dá)模式,且表達(dá)產(chǎn)物只在體壁上被檢測到。該基因ORF區(qū)域具有高GC含量特征。該蛋白序列中沒有RR共有序列以及其他幾丁質(zhì)結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域,但是存在AAPA/V序列以及其他一些表皮蛋白相關(guān)特征。對(duì)該基因進(jìn)行RNAi會(huì)造成蟲體變得干癟縮小或少量的蛻皮困難的表型現(xiàn)象。TEM觀察發(fā)現(xiàn)干癟縮小蟲體的內(nèi)表皮變得很薄;而一些沒有明顯表型的個(gè)體,內(nèi)表皮也出現(xiàn)部分的彎曲現(xiàn)象。冰凍切片免疫組織化學(xué)定位(IHC)結(jié)果顯示該蛋白位于原表皮上,我們推測該蛋白可能是內(nèi)表皮的一種重要的組分。6.對(duì)蛋白Nlegf-like的功能研究。通過對(duì)表皮蛋白數(shù)據(jù)庫和褐飛虱組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,鑒定了一個(gè)超大蛋白及其編碼基因,其ORF全長達(dá)到50922bp,可編碼一個(gè)含有16973個(gè)氨基酸的膜蛋白,氨基酸序列中含有260個(gè)EGF-like結(jié)構(gòu)域,其中有16個(gè)是Ca2+結(jié)合形式(cbEGFs)。該基因在體壁上高表達(dá),具有多種可變剪切轉(zhuǎn)錄本,不同轉(zhuǎn)錄本在齡期中期或末期高表達(dá)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示該基因在不同物種中具有保守性。用8段不重疊的雙鏈RNA(dsRNA)分別干擾該基因后,蟲體出現(xiàn)蛻皮困難或變瘦小最終死亡的表型。TEM觀察表明:出現(xiàn)身體縮小表型的蟲體,其內(nèi)表皮變得很薄;而在齡期末身體伸長背板無法開裂或無法完成蛻皮的蟲體,其舊表皮則沒有被充分消化。因此我們推測該基因?qū)Ρ砥さ男玛惔x發(fā)揮至關(guān)重要的作用。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S435.112.3
【部分圖文】：

成：由外而內(nèi)細(xì)分為外卵殼（ｅｘｏｃｈｏｒｉｏｎ，ｅｘｏ）、內(nèi)卵殼（ｅｎｄｏｃｈｏｒｉｏｎ，ｅｎ）、晶??體層（ｉｎｎｅｒｍｏｓｔ?ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ?ｌａｙｅｒ，?ＩＣＬ）和蠟層（ｗａｘ?ｌａｙｅｒ，?ｗａｘ）?（Ｐａｐａｓｓｉｄｅｒｉ?ｅｔ?ａｌ”??１９９１）（圖１．１）。卵殼對(duì)胚胎發(fā)育起到至關(guān)重要的作用：提供機(jī)械保護(hù)，使胚胎??免受外界傷害（ＳＬＩＦＥＲ?ａｎｄ?ＳＥＫＨＯＮ，１９６３），控制空氣和水的交換（Ｗｏｏｄｓ?ｅｔ?ａｌ．，??２００５，Ｚｒｕｂｅｋ?ａｎｄ?Ｗｏｏｄｓ，?２００５?），形成授精通道（Ｚａｒａｎｉ?ａｎｄ?Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ，?１９８６）等。??隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行，卵內(nèi)出現(xiàn)更多復(fù)雜的胚胎以及胚胎外結(jié)構(gòu)（圖１．２）。??圖１．１昆蟲卵殼結(jié)構(gòu)示意圖（圖引自Ｗｏｏｄｓ?ｅｔ?ａｌ．，?２００５）??從外到內(nèi)主要為：外卵殼（Ｅｘｏｃｈｏｒｉｏｎ，?Ｅｘｏ），內(nèi)卵殼（Ｅｎｄｏｃｈｏｒｉｏｎ，Ｅｎｄｏ），晶體層（ｉｎｎｅｒｍｏｓｔ??ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ?ｌａｙｅｒ，ＩＣＬ），蠟質(zhì)層（ｗａｘ?ｌａｙｅｒ，?ｗａｘ），卵黃膜（ｖｉｔｅｌｌｉｎｅ?ｅｎｖｅｌｏｐｅ，ＶＥ），內(nèi)部物質(zhì)（隨??著胚胎發(fā)育過程逐漸形成，包括漿膜表皮，漿膜，羊膜，胚胎，卵黃等）。??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｉｎｓｅｃｔ?ｃｈｏｒｉｏｎ?（Ｗｏｏｄｓ?ｅｔ?ａｌ．

成：由外而內(nèi)細(xì)分為外卵殼（ｅｘｏｃｈｏｒｉｏｎ，ｅｘｏ）、內(nèi)卵殼（ｅｎｄｏｃｈｏｒｉｏｎ，ｅｎ）、晶??體層（ｉｎｎｅｒｍｏｓｔ?ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ?ｌａｙｅｒ，?ＩＣＬ）和蠟層（ｗａｘ?ｌａｙｅｒ，?ｗａｘ）?（Ｐａｐａｓｓｉｄｅｒｉ?ｅｔ?ａｌ”??１９９１）（圖１．１）。卵殼對(duì)胚胎發(fā)育起到至關(guān)重要的作用：提供機(jī)械保護(hù)，使胚胎??免受外界傷害（ＳＬＩＦＥＲ?ａｎｄ?ＳＥＫＨＯＮ，１９６３），控制空氣和水的交換（Ｗｏｏｄｓ?ｅｔ?ａｌ．，??２００５，Ｚｒｕｂｅｋ?ａｎｄ?Ｗｏｏｄｓ，?２００５?），形成授精通道（Ｚａｒａｎｉ?ａｎｄ?Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓ，?１９８６）等。??隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行，卵內(nèi)出現(xiàn)更多復(fù)雜的胚胎以及胚胎外結(jié)構(gòu)（圖１．２）。??圖１．１昆蟲卵殼結(jié)構(gòu)示意圖（圖引自Ｗｏｏｄｓ?ｅｔ?ａｌ．，?２００５）??從外到內(nèi)主要為：外卵殼（Ｅｘｏｃｈｏｒｉｏｎ，?Ｅｘｏ），內(nèi)卵殼（Ｅｎｄｏｃｈｏｒｉｏｎ，Ｅｎｄｏ），晶體層（ｉｎｎｅｒｍｏｓｔ??ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ?ｌａｙｅｒ，ＩＣＬ），蠟質(zhì)層（ｗａｘ?ｌａｙｅｒ，?ｗａｘ），卵黃膜（ｖｉｔｅｌｌｉｎｅ?ｅｎｖｅｌｏｐｅ，ＶＥ），內(nèi)部物質(zhì)（隨??著胚胎發(fā)育過程逐漸形成，包括漿膜表皮，漿膜，羊膜，胚胎，卵黃等）。??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｉｎｓｅｃｔ?ｃｈｏｒｉｏｎ?（Ｗｏｏｄｓ?ｅｔ?ａｌ．

通常，在同時(shí)含有羊膜和漿膜的昆蟲中，羊膜位于里層，覆蓋在胚胎??的腹面，與胚胎之間形成了充滿羊水的羊膜腔；漿膜是外層膜，包裹著胚胎，羊??膜和卵黃，位于卵殼內(nèi)側(cè)（Ｌａｒｉｎｋ，?１９９７）（圖１．３）。但正如（Ｄｏｍ，?１９７６）中描??述的，胚胎外膜在不同的昆蟲中有很大的區(qū)別。幾乎所有的昆蟲在胚帶形成后都??會(huì)形成一個(gè)衆(zhòng)膜（Ｓｃｈｍｉｄｔ－ＯｔｔａｎｄＫｗａｎ，?２０１６），但在不同的物種中，羊膜區(qū)別??很大，如在模式昆蟲果繩（／＞〇鮮祕(mì)（７?ｗｅ／ａ？ｏｇａ濃ｒ）中，缺乏獨(dú)立的羊膜和衆(zhòng)??膜，在胚胎外只有一層簡化了的膜結(jié)構(gòu)，被命名為羊漿膜，僅僅覆蓋著卵黃??（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，?１９７２，?Ｓｃｈｍｉｄｔ－０ｔｔ，２０００）；而在一些膜翅目的昆蟲中，如蜜蜂（Ｆｌｅｉｇ??ａｎｄ?Ｓａｎｄｅｒ，?１９８８）和黃蜂（Ｂｕｌｌ，?１９８２）中，羊膜通常是缺失的，或只有一個(gè)臨??時(shí)的羊膜僅僅覆蓋著卵黃。在果蠅中
【參考文獻(xiàn)】

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1 馬艷;郝培應(yīng);陸潮峰;俞曉平;;褐飛虱表皮蛋白基因NlICP的克隆及功能研究[J];昆蟲學(xué)報(bào);2013年11期

2 程家安;朱金良;祝增榮;章連觀;;稻田飛虱災(zāi)變與環(huán)境調(diào)控[J];環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào);2008年02期

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1 張夢(mèng)秋;褐飛虱黑色素合成通路相關(guān)基因的功能分析[D];浙江大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2869630