植物可以產(chǎn)生很多初生和次生代謝物以維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育和抵御外界環(huán)境脅迫,而這些具有防御性的代謝物質(zhì)大多都來(lái)源于氨基酸合成和代謝路徑。雖然棉花含有豐富的次生代謝物質(zhì),但是這些物質(zhì)在棉花中的合成路徑以及在棉花生長(zhǎng)發(fā)育和防御反應(yīng)中的作用并不清楚。本研究前期通過(guò)擬南芥芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù),并結(jié)合棉花響應(yīng)黃萎病菌的RNA-Seq數(shù)據(jù)和抑制差減雜交文庫(kù),發(fā)現(xiàn)色氨酸合成路徑基因GbTSA1受多種真菌誘導(dǎo)表達(dá),推測(cè)該基因可能參與了植物廣譜響應(yīng)真菌侵染的抗病信號(hào)路徑或免疫調(diào)控。本研究基于以上結(jié)果對(duì)色氨酸合成路徑相關(guān)基因在棉花抗黃萎病中的功能進(jìn)行了解析,取得主要結(jié)果如下:1.GbTSA1表達(dá)模式分析組織表達(dá)模式分析顯示GbTSA1在棉花各個(gè)組織(根,莖稈,葉片,花瓣,0 d胚珠,5 d纖維)中均高量表達(dá);誘導(dǎo)表達(dá)模式分析顯示GbTSA1在棉花接種黃萎病菌初期表達(dá)顯著下降,在接種24 h后表達(dá)顯著上調(diào),同時(shí)該基因也受水楊酸處理誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá);亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示GbTSA1基因編碼的蛋白定位于葉綠體中。2.GbTSA1抑制表達(dá)材料增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病的抗性為了研究GbTSA1在棉花抗病中的功能,我們構(gòu)建了GbTSA1超量表達(dá)載體,RNAi抑制表達(dá)載體以及病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體,并獲得超表達(dá)株系(OS-2,OS-3,OS-5,OS-8)和抑制表達(dá)株系si-1。研究發(fā)現(xiàn),抑制GbTSA1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系si-1出現(xiàn)類病斑表型,同時(shí)伴隨SA合成路徑以及PR基因的顯著激活。利用病毒載體TRV:TSA1抑制GbTSA1表達(dá)后植株表現(xiàn)出與si-1相似的類病斑表型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),抑制GbTSA1表達(dá)后增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病菌的抗性,而超量表達(dá)GbTSA1后對(duì)棉花黃萎病的抗性影響不大。3.GbTSA1抑制表達(dá)材料表型形成依賴于水楊酸合成和信號(hào)路徑為了研究si-1以及TRV:TSA1抑制表達(dá)植株類病斑的形成機(jī)制,本研究將水楊酸合成路徑關(guān)鍵基因GbICS1以及信號(hào)路徑關(guān)鍵基因GbNPR1分別與GbTSA1進(jìn)行共抑制,結(jié)果表明共抑制GbICS1和GbNPR1后可以恢復(fù)TRV:TSA1抑制表達(dá)植株引發(fā)的類病斑及抗病的表型,說(shuō)明水楊酸合成的組成型激活是導(dǎo)致TRV:TSA1抑制表達(dá)植株出現(xiàn)壞死的原因。4.吲哚激活棉花抗病免疫反應(yīng)和SA合成由于色氨酸合成路徑和水楊酸合成路徑共用前體底物分支酸,為了解析si-1以及TRV:TSA1抑制表達(dá)植株引發(fā)水楊酸含量升高的機(jī)制,我們對(duì)整個(gè)色氨酸合成路徑進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,結(jié)果顯示類病斑表型的出現(xiàn)具有基因特異性,且不是由分支酸和色氨酸含量變化所致。此外,TRV:TSB1抑制表達(dá)植株也出現(xiàn)依賴于水楊酸信號(hào)路徑的類病斑表型。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明GbTSB1可以和GbTSA1互作形成復(fù)合體催化色氨酸合成的最后一步反應(yīng);代謝組分析發(fā)現(xiàn)TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表達(dá)植株吲哚以及吲哚類代謝物顯著積累;轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)吲哚可以激活抗病相關(guān)基因以及水楊酸合成相關(guān)基因GbSARD1,GbWRKY28等的表達(dá);雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明GbSARD1和GbWRKY28可以結(jié)合在GbICS1的啟動(dòng)子上,激活GbICS1的表達(dá);共抑制GbSARD1可以部分恢復(fù)TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表達(dá)植株類病斑表型;吲哚外施處理顯示吲哚可以增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病菌的抗性;以上結(jié)果表明,抑制GbTSA1和GbTSB1的表達(dá)能促進(jìn)其代謝底物吲哚以及吲哚類物質(zhì)在抑制表達(dá)植株中顯著積累,吲哚類物質(zhì)可以通過(guò)激活SA合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GbSARD1以及GbWRKY28的表達(dá),最終導(dǎo)致TRV:TSA1和TRV:TSB1抑制表達(dá)植株中SA含量顯著升高,PR基因組成型激活,植株出現(xiàn)類病斑和抗病表型。5.GbTRP1抑制表達(dá)植株積累鄰氨基苯甲酸類物質(zhì)本研究還發(fā)現(xiàn)色氨酸合成路徑基因GbTRP1抑制表達(dá)植株以及GbTRP1-RNAi轉(zhuǎn)基因株系也會(huì)產(chǎn)生類病斑表型,但在TRV:TRP1抑制表達(dá)植株中SA含量顯著降低。代謝組分析發(fā)現(xiàn)鄰氨基苯甲酸及其衍生物在TRV:TRP1抑制表達(dá)植株中顯著積累。后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步探討TRV:TRP1抑制表達(dá)植株和GbTRP1-RNAi轉(zhuǎn)基因株系出現(xiàn)類病斑的機(jī)制以及鄰氨基苯甲酸與水楊酸(鄰羥基苯甲酸)在植物抗病反應(yīng)中的聯(lián)系。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S435.621
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
1 前言
    1.1 植物抗病機(jī)制
        1.1.1 植物先天免疫系統(tǒng)
        1.1.2 植物超敏反應(yīng)和類病斑突變體參與的抗病反應(yīng)
        1.1.3 植物氨基酸代謝參與的抗病反應(yīng)
        1.1.4 植物激素水楊酸介導(dǎo)的抗病反應(yīng)
    1.2 棉花黃萎病及抗病機(jī)制解析
        1.2.1 棉花黃萎病菌致病機(jī)制
        1.2.2 棉花對(duì)黃萎病菌的組織結(jié)構(gòu)抗性
        1.2.3 棉花中R基因介導(dǎo)的抗性及機(jī)制解析
        1.2.4 激素信號(hào)路徑在棉花抗黃萎病菌中的作用
        1.2.5 次生代謝物質(zhì)在棉花抗黃萎病菌中的作用
    1.3 色氨酸合成和代謝路徑在植物抗病中的作用
        1.3.1 色氨酸合成路徑研究進(jìn)展
        1.3.2 色氨酸代謝路徑在抗病和抗蟲(chóng)反應(yīng)中的作用
    1.4 研究問(wèn)題的由來(lái)與意義
2 材料方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料,載體和菌株
        2.1.2 試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 GbTSA1 基因的分離和克隆
        2.2.2 載體構(gòu)建
        2.2.3 棉花遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.4 棉花核酸提取和Southern雜交
        2.2.5 反轉(zhuǎn)錄以及RT-qPCR基因表達(dá)量分析
        2.2.6 黃萎病菌的活化和培養(yǎng)、接種、病指統(tǒng)計(jì)、恢復(fù)培養(yǎng)
        2.2.7 水楊酸,色氨酸,吲哚處理棉花
        2.2.8 病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）
        2.2.9 HPLC-MS法測(cè)量棉花內(nèi)源激素,色氨酸,以及分支酸含量
        2.2.10 GC-MS法測(cè)量吲哚含量
        2.2.11 GbTSA1 基因亞細(xì)胞定位
        2.2.12 酵母雙雜交和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
        2.2.13 吲哚處理轉(zhuǎn)錄組分析
3 結(jié)果分析
    3.1 GbTSA1 基因的克隆及分子檢測(cè)
        3.1.1 棉花中Gb TSA1 基因的分離和克隆
        3.1.2 GbTSA1 基因蛋白亞細(xì)胞定位,組織表達(dá)模式和誘導(dǎo)表達(dá)模式
    3.2 GbTSA1 轉(zhuǎn)基因材料的表型鑒定
        3.2.1 GbTSA1 轉(zhuǎn)基因株系的獲得及表型鑒定
        3.2.2 TRV:TSA1 抑制表達(dá)植株表型鑒定
    3.3 GbTSA1 超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和抑制表達(dá)植株抗病性鑒定
    3.4 GbTSA1-RNAi以及TRV:TSA1 植株類病斑形成依賴于SA合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑
        3.4.1 共沉默Gb ICS1或GbNPR1 抑制TRV:TSA1 植株類病斑表型
        3.4.2 共沉默GbICS1或Gb NPR1 抑制TRV:TSA1 植株抗病表型
        3.4.3 外施SA可以顯著增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病菌的抗性
    3.5 類病斑表型在色氨酸合成路徑中具有基因特異性且不依賴于色氨酸
        3.5.1 色氨酸合成路徑基因在棉花中的克隆和挖掘
        3.5.2 TRV:Trp-synthesis related genes抑制表達(dá)植株的表型鑒定
        3.5.3 外施色氨酸不能抑制TRV:TRP1,TRV:TSA1,TRV:TSB1 植株類病斑表型
    3.6 TRV:TSB1 抑制表達(dá)植株類病斑表型依賴于SA信號(hào)路徑
    3.7 外源施加吲哚可以增強(qiáng)植物抗病反應(yīng)以及SA信號(hào)路徑
        3.7.1 TRV:TSA1和TRV:TSB1 抑制表達(dá)植株吲哚以及吲哚類衍生物含量測(cè)定..
        3.7.2 外源施加吲哚增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病菌的抗性
        3.7.3 吲哚處理轉(zhuǎn)錄組分析
        3.7.4 吲哚激活SA合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子GbSARD以及GbWRKY28 的表達(dá)
        3.7.5 外源施加吲哚不能抑制黃萎病菌的生長(zhǎng)
    3.8 GbTRP1-RNAi和 TRV:TRP1 抑制表達(dá)植株增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病菌以及灰霉的抗性
    3.9 TRV:TRP1 抑制表達(dá)植株中積累大量鄰氨基苯甲酸類物質(zhì)
    3.10 TRV:Trp-synthesis related genes植株類病斑表型以及抗病表型形成機(jī)制總結(jié)
4 討論
    4.1 VIGS技術(shù)在候選基因功能驗(yàn)證中的作用
    4.2 色氨酸合成和代謝路徑與SA信號(hào)路徑之間的關(guān)系
    4.3 植物類病斑突變體與SA信號(hào)路徑之間的關(guān)系
    4.4 鄰氨基苯甲酸類物質(zhì)具有抑菌作用
    4.5 吲哚類代謝物質(zhì)在棉花抗黃萎病中的作用
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 載體構(gòu)建
    附錄2 DNA提取
    附錄3 Sourthern雜交（地高辛標(biāo)記法）
    附錄4 棉花RNA提取
    附錄5 培養(yǎng)基配方
    附錄6 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)
    附錄7 原生質(zhì)體分離和轉(zhuǎn)化以及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
附表
攻讀學(xué)位期間已發(fā)表的論文和待發(fā)表的論文
申請(qǐng)專利
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2869436