目的:為了提高實驗室前期篩選出的,能有效防治棉花土傳病害的2株拮抗芽孢桿菌,Bacillus atrophaeus B44和Bacillus subtilis S37的持效期和防病效果,篩選出緩釋包衣材料并制備芽孢桿菌緩釋劑,通過盆栽實驗,測定其對棉苗立枯病的防效及其作用機制。為更合理的使用芽孢桿菌制劑防治棉苗立枯病提供技術支撐。方法:通過Spizizen法將質粒PGF4412分別轉化到2株芽孢桿菌Bacillus subtilis S37和Bacillus atrophaeus B44中,進行綠色熒光標記與抗性標記;隨后選擇單寧酸與三氯化鐵、明膠與γ-聚谷氨酸、碳酸鈣與多巴胺3種不同緩釋材料組合制備緩釋劑,通過抗性培養(yǎng)基回收計數(shù)法,測定緩釋菌劑的貯藏穩(wěn)定性,通過盆栽實驗測定其在棉花土壤根際的持效周期及其對棉苗立枯病的防效;選擇3種不同的化學殺菌劑,22%的氟唑菌苯胺(FS)、甲霜·種菌唑(ME)、多菌靈(WP),以及混合菌劑、清水作為對照處理,比較緩釋菌劑在不同溫度下,對棉種的發(fā)芽率、出苗率,以及株高等農(nóng)藝性狀的影響,評價緩釋菌劑對棉苗在低溫脅迫下的保護作用效果,并測定棉花在5~oC、15~oC和25~oC,3個溫度條件下,經(jīng)過不同脅迫天數(shù)后,棉花組織生理指標的變化,評價緩釋菌劑對棉苗在低溫脅迫下的保護作用機制。結果:1、在使用抗性平板氨芐青霉素終濃度為15μg/mL時,成功將帶有GFP的質粒PGF4412轉化進芽孢桿菌B.atrophaeus B44進行熒光標記,而成功轉化B.subtilis S37的氨芐青霉素終濃度為20μg/m L。將帶有GFP標記的芽孢桿菌施用到棉花根部后,發(fā)現(xiàn)這兩株菌僅在棉苗根表定殖。且初始接菌量越高,兩株菌在土壤中及棉苗根表的定殖量越高。其中B44在初始接菌量最大時對棉苗立枯病的防效最好,S37在初始接菌量為1×10~8 CFU/g時,對棉苗立枯病的防效達到51.7%。2、對不同包衣材料進行篩選發(fā)現(xiàn),碳酸鈣與多巴胺組合制備聚多巴胺芽孢桿菌緩釋劑的包覆率以及其在不同pH的PBS緩沖液中的釋放率最好,其包覆率為87.4%,在常溫下貯存200 d后,菌體存活率仍高達91.33%。盆栽結果顯示,使用2.5 g/200粒棉籽的混合芽孢桿菌菌劑拌種后,其對棉苗立枯病的防效為48.4%,而以相同濃度的聚多巴胺緩釋菌劑拌種后,其對棉苗立枯病的防效達到54.6%,差異顯著;并且在該濃度條件下,緩釋菌劑在土壤中40d后的菌落密度下降為4.33×10~6 CFU/g,而混合菌劑則為3.04×10~6CFU/g,存活數(shù)量和持效期顯著提高。3、3種化學藥劑,以及混合芽孢桿菌和緩釋菌劑對棉花種子進行包衣處理,均能提高棉花在低溫脅迫下的發(fā)芽率與出苗率。在15~oC低溫脅迫下,緩釋菌劑處理棉種后的保護作用效果更為顯著,對棉種的發(fā)芽率、出苗率分別提高了19.6%和11.3%,在低溫處理第5 d后,使植物組織的蛋白含量增加了28.4%,H_2O_2的累積減少49.6%,PAL的產(chǎn)生提高28.3%。在適溫25~oC下,緩釋菌劑對棉苗具有顯著促進生長的作用,但在更低溫度5~oC下,緩釋菌劑對棉苗抗低溫脅迫的保護作用效果并不顯著。結論:兩株菌均只能在棉苗根表及根際土壤定殖,且定殖量與兩株菌對棉苗立枯病的防效之間為正相關。篩選得到聚多巴胺與碳酸鈣組合的包衣材料,對兩株芽孢桿菌的包覆效果最為理想,該材料包覆形成的緩釋菌劑常溫貯藏200 d的穩(wěn)定性高達91.33%,并且其在土壤中的菌落密度下降率也低于混合菌劑。緩釋菌劑在15~oC低溫脅迫下,其對提高棉種發(fā)芽率、出苗率及其他指標均有顯著效果,但不及化學藥劑甲霜·種菌唑和多菌靈這2種藥劑的作用效果明顯,與氟唑菌苯胺和混合菌劑相近。
【學位單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TQ450.14
【部分圖文】：

B.atrophaeusB44 在棉花表面的定殖; B,B.subtilisS37 在棉花表面圖 2.3 標記菌株在棉花上的定殖Fig.2.3Colonization of marked strains on cotton root菌在棉花根際土壤及根表的定殖動態(tài)變化得，兩株菌在根際土壤及根表的定殖量不僅與菌的種類 在初始濃度為 1×106、1×107和 1×108CFU/mL 時，30 d05、8.8×105和 4.24×106CFU/g，而其在根表的定殖量×104CFU/g。S37 在根際土壤中的定殖量相對高于 B444.3×105、1.26×106和7.1×106CFU/g，而其在根表的定殖×104CFU/g，與 B44 相差不大（圖 2.5）。兩株芽孢桿菌期定殖量相對越大。15B10 B10 B10

芽孢桿菌緩釋劑的制備及其緩釋效能的研究析的形態(tài)觀察及三氯化鐵對芽孢桿菌并無影響，但單寧酸與三氯化鐵貯藏穩(wěn)定性，30d 后該方法制備所得芽孢桿菌制劑菌法制備出的緩釋劑僅將芽孢桿菌隨機聚合到了一起，和 Y-聚谷氨酸制備的緩釋劑，僅在單個的芽孢桿菌表層，但卻沒有聚合效果，并且包覆率也較低，無緩釋效果用會形成的較為規(guī)則的碳酸鈣小球，將 2-4 個芽孢桿菌蓋一層對 pH 敏感的聚多巴胺納米層，能夠較好的響應芽孢桿菌起到一定的保護作用（圖 3.1C）。因此僅選擇出的多巴胺緩釋菌劑進行后續(xù)試驗。
【參考文獻】

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本文編號：2860339