煙草青枯病(Tobacco Bacterial Wilt)由青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起的毀滅性土傳細(xì)菌性病害,對(duì)煙草的產(chǎn)量、品質(zhì)和土地的綜合利用帶來了巨大的危害,是制約我國(guó)煙草行業(yè)發(fā)展的瓶頸之一。培育抗病品種是迄今防治青枯病最有效的途徑,本研究首先對(duì)福建泰寧和安徽宣城煙草青枯菌系分化進(jìn)行了研究;其次,建立了青枯病抗性的室內(nèi)精準(zhǔn)鑒定體系,然后對(duì)14個(gè)突變體及三個(gè)對(duì)照品種進(jìn)行了青枯病抗性鑒定,對(duì)其抗性遺傳規(guī)律進(jìn)行了初步分析;最后,通過RNA-Sequencing技術(shù)揭示了煙草與病原菌互作過程中差異表達(dá)基因的情況,結(jié)合qRT-PCR技術(shù)對(duì)其中參與抗青枯病的差異基因進(jìn)行了表達(dá)量分析,為抗性機(jī)理研究和煙草青枯病的防治提供遺傳資源和理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.對(duì)福建泰寧和安徽宣城菌株分別接種3種雙糖(乳糖、麥芽糖、纖維二糖)和3種已醇(甘露醇、山梨醇、甜醇)進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定。結(jié)果顯示,15d后兩地菌株在各培養(yǎng)基上均能夠正常生長(zhǎng),且供試菌株在各培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈橘黃色,3種雙糖和3種已醇均能被供試菌株利用,因此,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)描述,推斷供試菌株為生化型III;這也與己報(bào)道的侵染中國(guó)煙草的青枯菌主要為生化型III相符合。2.利用感病對(duì)照“紅花大金元”、“翠碧一號(hào)”和抗病對(duì)照“巖煙97”三個(gè)對(duì)照品種為研究對(duì)象,探索室內(nèi)精準(zhǔn)鑒定體系,結(jié)果顯示,利用傷根浸泡法,以1×10~8 cfu/mL濃度的青枯菌懸液進(jìn)行浸染、第12d調(diào)查獲得的發(fā)病情況主要評(píng)價(jià)指標(biāo),供試材料的室內(nèi)病情指數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的真實(shí)病情指數(shù)一致,由此可見,室內(nèi)可控條件下的傷根浸泡法能夠真實(shí)地反映材料的抗性水平,具有快速、經(jīng)濟(jì)、可靠的優(yōu)點(diǎn),可以作為煙草青枯病抗性鑒定的重要手段。3.選用14個(gè)經(jīng)EMS誘變獲得的煙草抗青枯病突變體及“紅花大金元”、“翠碧一號(hào)”、“巖煙97”三個(gè)對(duì)照品種為材料進(jìn)行室內(nèi)接種鑒定,結(jié)果顯示,17個(gè)供試材料的室內(nèi)抗病率與田間自然病圃抗病率非常接近,呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.964,評(píng)價(jià)了突變體的抗性;利用感病親本“翠碧一號(hào)”和“紅花大金元”,分別與抗病親本359-k、633-k、N1561-1、1412-k1分別配制正反交組合,初步表明突變體青枯病抗性遺傳受隱性核基因控制。4.對(duì)抗青枯病突變體和感病材料“翠碧一號(hào)”接種青枯菌強(qiáng)毒株后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),通過RNA-Sequencing技術(shù)篩出了大量的差異基因,且差異基因主要以上調(diào)為主。青枯菌的侵染會(huì)啟動(dòng)煙草多條代謝通路,如植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原菌的互作、氧化磷酸化和嘧啶代謝等,以及相關(guān)基因的表達(dá),主要涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、催化活性、有機(jī)物代謝、生物合成等,這也表明煙草-病原菌互作是非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)過程。5.選取了8個(gè)可能和抗病性相關(guān)的差異表達(dá)基因在野生型和突變體633-k、1412-k1中進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證,以確定是否參與了煙草抗青枯病反應(yīng),結(jié)果表明,Ntab0876820和Ntab0833810基因在抗感材料接菌后的表達(dá)強(qiáng)度不同,在突變體633-k、1412-k1中,其表達(dá)強(qiáng)度隨著接種天數(shù)的增加而增加,而在野生型侵染前后表達(dá)強(qiáng)度無明顯變化。Ntab0876820基因中含有WRKY轉(zhuǎn)錄因子,Ntab0833810參與細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.72
【部分圖文】：

是世界煙草生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害之一，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量與品（Tans-Kersten et al.,2010）。自 1880 年首先在美國(guó)的北卡羅來納州格蘭維爾（Granville，縣名現(xiàn)以來，現(xiàn)已在世界各大煙草種植區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，在介于北緯 450至南緯 450之間的亞熱帶和一些暖的煙草種植區(qū)發(fā)病情況尤為明顯，在我國(guó)煙草青枯病普遍發(fā)生，其中南方煙區(qū)最為嚴(yán)重，且病害常與黑脛病、根結(jié)線蟲病等根莖類病害混合發(fā)生（劉勇等，2007）。近年來，該病害分布區(qū)逐步擴(kuò)大，山東、河南、遼寧等煙區(qū)亦有分布。福建省平均煙草青枯病發(fā)病率高達(dá) 40%；湖南青枯病發(fā)病率在中西部約為 10～30%，嚴(yán)重的達(dá) 40～85%；安徽省青枯病病情發(fā)展速度非�？�2006 年病害面積超過 500hm2，除土地利用損失以外，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)300萬元（季學(xué)軍等，200國(guó)內(nèi)外每年因煙草青枯病造成數(shù)億元的經(jīng)濟(jì)損失，青枯病成為影響煙草生產(chǎn)第四大細(xì)菌性病害1.1.2 病害癥狀煙草青枯�。═obacco Bacterial Wilt）為典型的維管束病害，病菌可侵害煙株根、莖、葉的部分。煙草青枯病最典型的癥狀是葉片枯萎及莖部一側(cè)發(fā)黑。發(fā)病時(shí)期，病株的莖上一側(cè)有褪條斑、葉片萎焉，而一側(cè)莖部生長(zhǎng)正常、葉片正常。發(fā)病中期，煙株莖部從褪綠條斑變?yōu)楹谏�，可一直延伸煙株頂部，葉肉變黃且葉脈變黑，葉片全部萎焉，這時(shí)撥出根部，帶有條斑的和根部變黑腐爛，用力擠壓發(fā)病處有黃白色乳狀粘液，即青枯菌 菌膿 （徐德樹等，2010）。病后期，青枯菌侵入髓部，隨后髓部呈蜂窩狀或腐爛變空，直至整株枯死（圖 1.1）。

中取得了豐富成果，如水稻抗白枯病基因 Xa1、Xa2，擬南等（1997）利用 EMS 誘導(dǎo)煙草花藥，進(jìn)行篩選鑒定出抗黃院煙草研究所生物技術(shù)研究中心所牽頭煙草突變體庫創(chuàng)插入等突變方式對(duì)紅花大金元、中煙 100、巖煙 97 等主栽、香氣、品質(zhì)等接近應(yīng)用于生產(chǎn)的突變體，而且還有葉色突變體，為功能基因的研究和品種培育提供了資源。測(cè)序技術(shù)的原理和應(yīng)用組測(cè)序的原理是基于二代高通量測(cè)序技術(shù)建立起來的，具有適用性強(qiáng)、測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，因此轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基祁云霞等，2011）。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序主要包括總 RNA 的提取、等步驟，具體流程見（圖 1.2）。數(shù)據(jù)分析是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的、富集分析、主成分分析、代謝通路分析，獲得轉(zhuǎn)錄組信為品種繁育、分子標(biāo)記開發(fā)等提供大量數(shù)據(jù)資料。

試驗(yàn)技術(shù)流程
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2860650