禾谷鐮刀菌是小麥赤霉病的優(yōu)勢(shì)種之一,該病菌不僅嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì),其在侵染過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生赤霉菌毒素,對(duì)人畜健康造成較大威脅。微管是細(xì)胞骨架的重要組分,在真菌的極性生長(zhǎng)、物質(zhì)運(yùn)輸、有絲分裂和維持細(xì)胞形態(tài)等眾多生物學(xué)過(guò)程中起重要作用。同時(shí),微管作為苯并咪唑類(lèi)殺菌劑的作用靶標(biāo)在病害防治中具有重要意義。微管功能依賴于與其結(jié)合的微管相關(guān)蛋白,目前對(duì)微管和微管相關(guān)蛋白的研究已發(fā)展為細(xì)胞生物學(xué)的一個(gè)重要分支。在禾谷鐮刀菌中,存在兩個(gè)β-微管蛋白FgTub1和FgTub2。已知兩個(gè)β-微管蛋白之間存在明顯的功能分化,FgTUB1為有性生殖所必需,FgTUB2與病菌抗藥性和菌絲生長(zhǎng)密切相關(guān),將FgTUB2敲除后會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢,菌落變小。本研究在對(duì)Fgtub2突變體培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),其易自發(fā)突變形成生長(zhǎng)恢復(fù)的角變子。對(duì)角變子進(jìn)行收集共計(jì)38個(gè),按照生長(zhǎng)速率快慢分為3種類(lèi)型,選取每類(lèi)3-4個(gè)代表菌株,共計(jì)14個(gè)進(jìn)行了全基因組重測(cè)序,分析篩選可能與FgTUB2相關(guān)的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn),角變子b-9-1s和b-10-6分別在FgKAR9基因上發(fā)生了不同位置的終止突變。為驗(yàn)證是否因FgKAR9基因突變引起的角變現(xiàn)象,我們使用Split-PCR的方法在Fgtub2突變體中敲除FgKAR9和在Fgkar9突變體中敲除FgTUB2獲得了Fgtub2kar9和Fgkar9tub2雙敲突變體;對(duì)角變子b-9-1s、b-10-6和Fgtub2kar9、Fgkar9tub2的表型進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)b-9-1s、b-10-6的生長(zhǎng)速率、致病力較Fgtub2有部分恢復(fù),產(chǎn)孢量和有性生殖正常;突變體Fgtub2kar9、Fgkar9tub2與其角變子在生長(zhǎng)速率、致病力等各方面表型均一致,說(shuō)明FgKAR9發(fā)生終止突變能部分彌補(bǔ)FgTUB2基因缺失帶來(lái)的表型缺陷。通過(guò)基因敲除、PCR檢測(cè)和southern驗(yàn)證,得到2個(gè)Fgkar9缺失突變體菌株。對(duì)其進(jìn)行表型觀察發(fā)現(xiàn)其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和有性生殖均正常。通過(guò)將FgKAR9融合到帶有RP27強(qiáng)啟動(dòng)子的pFL2質(zhì)粒中得到融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入PH-1獲得FgKAR9過(guò)表達(dá)菌株,對(duì)其進(jìn)行表型觀察也未發(fā)現(xiàn)異常。對(duì)FgKAR9進(jìn)行亞細(xì)胞定位觀察發(fā)現(xiàn),FgKar9蛋白在細(xì)胞中沿著FgTub2微管蛋白絲進(jìn)行高速運(yùn)動(dòng),表現(xiàn)為不連續(xù)的線狀,并且在芽管的頂端有少量富集。通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明FgTub2與FgKar9互作,表明FgKAR9在微管功能的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)證明FgKar9與FgBim1互作,推測(cè)FgKAR9可能與FgBIM1共同調(diào)節(jié)微管功能。綜上所述,本研究從Fgtub2突變體產(chǎn)生的角變子出發(fā),得出微管相關(guān)蛋白FgKAR9基因在微管功能的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,通過(guò)對(duì)FgKAR9及其互作蛋白的鑒定和功能分析,初步揭示了禾谷鐮刀菌中FgKAR9引起Fgtub2突變體發(fā)生角變的機(jī)理。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：S435.121.45
【部分圖文】：

子（無(wú)性孢子）和子囊孢子（有性孢子），分生孢子面會(huì)產(chǎn)生顏色紫黑色的卵圓狀子囊殼，其頂端有呈瘤放，子囊內(nèi)含 8 個(gè)子囊孢子。子囊孢子無(wú)色，兩端鈍, 2004; 武愛(ài)波等 2005)。為害多種禾本科糧食作物，在田間擁有眾多寄主。在包括小麥玉米、水稻、棉花等重要作物以及狗尾草、云平 2006）。小麥的整個(gè)生育期均可能受到禾谷鐮刀腐和穗枯等癥狀，病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可使小麥田顆粒于帶菌的種子和病殘?bào)w，適宜條件下，這些病殘?bào)w快子囊孢子，孢子借助風(fēng)雨、昆蟲(chóng)等媒介從而傳播到禾濕的條件下，受到該病菌侵染的小麥穗部會(huì)出現(xiàn)大量雨和其它媒介轉(zhuǎn)移到鄰近小麥上引起再侵染，如此循發(fā)。到發(fā)病后期天氣潮濕的情況下，發(fā)病小麥穗部的，在條件適宜時(shí)子囊孢子則可成為下一個(gè)侵染循環(huán)的初

YEPD 培養(yǎng)基的破碎杯中進(jìn)行破碎，2-3 次，每次 10-15 秒。后 ℃搖培 24 h，再重復(fù)破碎一次，25 ℃搖培 12-16 h，開(kāi)始收集菌收集到菌絲壓干水分，置于液氮中預(yù)冷，送公司做重測(cè)序分析。果2 突變體在 V8 培養(yǎng)基上發(fā)生角變gtub2 突變體進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其在 V8 培養(yǎng)基上出現(xiàn)了菌角變現(xiàn)象（圖 2-1）。WT Fgtub2

圖 2-2 禾谷鐮刀菌 FgKAR9 與其它真菌同源基因的多序列比對(duì)以及 b-9-1s、b-10-6發(fā)生終止突變的位置Figure 2-2 Multiple sequence alignment of F. graminearum FgKAR9 with other fungalhomologous genes and the termination mutations of b-9-1s and b-10-69
【參考文獻(xiàn)】

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1 鄭直;劉大群;馬平;;利用小麥單染色體代換系研究赤霉病抗性和抑制毒素產(chǎn)生的基因[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2008年02期

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1 武愛(ài)波;禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）致病力鑒定、毒素檢測(cè)及其分子生物學(xué)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

本文編號(hào)：2860207