煙粉虱作為世界性“超級害蟲”,除了直接取食為害蔬菜和花卉外,還可以間接傳播植物病毒,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Wolbachia和Cardinium廣泛分布于節(jié)肢動物中,利用Wolbachia所誘導(dǎo)的胞質(zhì)不親和(CI)來控制醫(yī)學(xué)媒介昆蟲已被證明是可行的,而Cardinium誘導(dǎo)的CI作用報(bào)道不多。黑腹果蠅體內(nèi)wMel菌株因誘導(dǎo)CI和阻斷登革熱疾病傳播而引起重視。但該株系能否在遠(yuǎn)緣宿主昆蟲中定殖并誘導(dǎo)CI尚不清楚。本研究通過顯微注射,將該Wolbachia株系人工轉(zhuǎn)入遠(yuǎn)緣宿主煙粉虱中,旨在探討wMel菌株在煙粉虱中能否穩(wěn)定遺傳,并監(jiān)測外源Wolbachia在新宿主體內(nèi)的滴度動態(tài)變化及兩種共生菌所誘導(dǎo)的宿主表型,從而為利用Wolbachia控制煙粉虱種群提供理論依據(jù)。此外,本文通過轉(zhuǎn)錄組測序,研究煙粉虱對于外源Wolbachia轉(zhuǎn)染所產(chǎn)生的分子響應(yīng),以探討Wolbachia與宿主間的互作機(jī)制。本文取得了一系列重要的研究結(jié)果如下:(一)從黑腹果蠅中分離純化Wolbachia,通過顯微注射將其轉(zhuǎn)入煙粉虱中,并構(gòu)建煙粉虱轉(zhuǎn)染單雌系。基于對單雌系的分子檢測,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后第15代(G15)煙粉虱體內(nèi)依然能夠檢測到wMel菌株,說明外源wMel菌株已被成功轉(zhuǎn)入新宿主體內(nèi),但各世代的母系傳遞率呈波動趨勢;(二)采用FISH檢測和定位煙粉虱體內(nèi)外源Wolbachia和Cardinium和結(jié)果表明轉(zhuǎn)染煙粉虱在不同世代和不同發(fā)育階段均能檢測到熒光信號,且含菌胞中信號最強(qiáng);Cardinium在偽蛹中熒光信號強(qiáng),含菌胞和周圍組織及頭上部均有分布,而成蟲中主要分布于腹部含菌胞中;(三)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)染煙粉虱在不同世代和不同性別的不同發(fā)育階段的wMel菌株滴度,連續(xù)檢測12代的結(jié)果表明不同世代間菌株滴度總體呈現(xiàn)先下降后上升的波動模式,且在G6代滴度達(dá)到峰值�？傮w上雌蟲體內(nèi)Wolbachia滴度顯著高于雄蟲,若蟲高于成蟲。而線性分析結(jié)果表明,其滴度變化與傳播效率動態(tài)沒有顯著相關(guān)性;(四)通過對轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染外源Wolbachia的煙粉虱進(jìn)行不同組配的雜交實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明wMel菌株能誘導(dǎo)煙粉虱表達(dá)強(qiáng)烈的CI,且對受體宿土適合度沒有顯著影響;同時(shí),Cardinium對煙粉虱種群不誘導(dǎo)CI,進(jìn)一步證明了外源Wolbachia誘導(dǎo)煙粉虱產(chǎn)生的CI作用。(五)采用不同方式釋放轉(zhuǎn)染煙粉虱的結(jié)果表明,與連續(xù)三代僅釋放轉(zhuǎn)染雌蟲或者交叉混合釋放轉(zhuǎn)染雌蟲或雄蟲相比,僅投放感染雄蟲使后代雄性比例高達(dá)73.3%,可嚴(yán)重扭曲靶標(biāo)種群的性比,這為利用wMel菌株控制煙粉虱種群提供了有價(jià)值的證據(jù)。(六)對轉(zhuǎn)染24h后的煙粉虱及野生型進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,結(jié)果顯示wMel菌株的轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)了 1579個(gè)Unigene的差異表達(dá)。Wolbachia感染抑制了 Toll和Imd信號傳導(dǎo)通路產(chǎn)生抗菌肽分子和解毒酶生物合成,但不能限制宿主的自噬和包囊作用。綜上,本研究成功將外源Walachia wMel菌株人工轉(zhuǎn)染到煙粉虱體內(nèi),并對wMel菌株在后代種群中的傳遞動態(tài)進(jìn)行了較長期的監(jiān)測。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行了生物雜交實(shí)驗(yàn),證明wMel菌株可誘導(dǎo)煙粉虱產(chǎn)生強(qiáng)烈的CI。基于此,本文進(jìn)行了煙粉虱籠罩種群控制實(shí)驗(yàn),展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。最后,作者對轉(zhuǎn)染單雌系進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)了大量有價(jià)值的候選基因,為進(jìn)一步驗(yàn)證候選基因功能和深入研究Wolbachia-宿主互作關(guān)系奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),也為利用Wolbachia調(diào)控?zé)煼凼戎匾r(nóng)業(yè)害蟲種群的實(shí)踐提供了重要的科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S433
【部分圖文】：

第二章外驟包括：??蠅雌成蟲，去掉翅、頭、足，用７０％乙醇沖洗３次，濾紙吸Ｔ水分后放入〗．５?ｍＬ離心管；??５０隊(duì)ＰＢＳ緩沖液（含３０％蔗糖），用研磨棒允分次，毎次５（ＨｉＬ：??ｇ，?４°Ｃ條件下離心５?ｍｉｎ，收集上淸；??００?ｇ，?４°Ｃ條件下離心４５?ｍｉｎ后小心傾倒上淸：??吣含３０％?Ｐｅｒｃｏｌｌ的Ｈｅｐｅｓ緩沖液重懸；???ｇ，４°Ｃ下離心４５?ｍｉｎ，分三層；??的白色斜面區(qū)域，轉(zhuǎn)入新的離心管，加入２００?ｕＬＳＰ?ｇ離心４５?ｍｉｎ，棄上清；??Ｌ?ＳＰＧ緩沖液重懸，冰上孵育２ｈ；??用紫外分光光度計(jì)測濃度后，置于－８０°Ｃ儲存待用。??

為了進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)室果繩Ｆｏ／ｔｏｃＷａ株系，對Ｚ）．７ｎａ／ａｎｏｇｃｗｔｏ■體內(nèi)ｆＦｏ／ｔｏｃ／ｚｚ’ａ五個(gè)持家??基因（ｇａ泌、ｃｏｘ４、ｔｅｐｄ、步Ｚ、＿／Ｚ＾）進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，產(chǎn)物在２％瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行電泳，??結(jié)果如圖２－３所示：可以看到各引物均擴(kuò)增出５００?ｂｐ左右單一明亮的目的條帶，條帶經(jīng)切膠回??收、連接轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，菌液送公司進(jìn)行測序。使用ＤＮＡＭＡＮ軟件對５個(gè)持家基因的??測序結(jié)果進(jìn)行拼接比對，結(jié)果顯不Ａｃｐｄ、ｃｏｘ＾、糾５、＿／６／３＾、＿／＾基因片段大小分別為５〗５沖、??４８７?ｂｐ、４７１?ｂｐ、５０９?ｂｐ?和?５２４?ｂｐ。??將ＭＬＳＴ５個(gè)持家基因和ｗｓｐ基因的測序結(jié)果在ＰｕｂＭＬＳＴＤａｔａｂａｓｅ上比對后（表２－３），??５個(gè)基因的等位基因編號均是１，由于５個(gè)等位基因組合得到的ＭＬＳＴ等位基因圖譜即是??Ｐｆｏ／ｔｏｃｔｏ？所屬株系的序列號，因此實(shí)驗(yàn)室黑腹果蠅體內(nèi)ｆＦｏ／ｂａｃ—序列型ＳＴ為１，與ｗＭｅｌ??株系序列型一致�；蛐蛄斜葘箫@示ＨＶＲ１序列號為１，?ＨＶＲ２序列號為１２，ＨＶＲ３的??序列號為２１

７５０ｂｐ＿”??５００ｂｐ??圖２－３黑腹果蠅體內(nèi)的ｗｓｐ基因擴(kuò)增圖??Ｆｉｇ．?２－３?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｗｓｐ?ｇｅｎｅ?ｏｆ?Ｗｏｌｂａｃｈｉａ?ｉｎ?Ｄ．?ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ??２．２．２?ＭＬＳＴ?５個(gè)持家基因擴(kuò)增??為了進(jìn)一步證實(shí)實(shí)驗(yàn)室果繩Ｆｏ／ｔｏｃＷａ株系，對Ｚ）．７ｎａ／ａｎｏｇｃｗｔｏ■體內(nèi)ｆＦｏ／ｔｏｃ／ｚｚ’ａ五個(gè)持家??基因（ｇａ泌、ｃｏｘ４、ｔｅｐｄ、步Ｚ、＿／Ｚ＾）進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，產(chǎn)物在２％瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行電泳，??結(jié)果如圖２－３所示：可以看到各引物均擴(kuò)增出５００?ｂｐ左右單一明亮的目的條帶，條帶經(jīng)切膠回??收、連接轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，菌液送公司進(jìn)行測序。使用ＤＮＡＭＡＮ軟件對５個(gè)持家基因的??測序結(jié)果進(jìn)行拼接比對，結(jié)果顯不Ａｃｐｄ、ｃｏｘ＾、糾５、＿／６／３＾、＿／＾基因片段大小分別為５〗５沖、??４８７?ｂｐ、４７１?ｂｐ、５０９?ｂｐ?和?５２４?ｂｐ。??將ＭＬＳＴ５個(gè)持家基因和ｗｓｐ基因的測序結(jié)果在ＰｕｂＭＬＳＴＤａｔａｂａｓｅ上比對后（表２－３），??５個(gè)基因的等位基因編號均是１，由于５個(gè)等位基因組合得到的ＭＬＳＴ等位基因圖譜即是??Ｐｆｏ／ｔｏｃｔｏ？所屬株系的序列號
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本文編號：2842480