柑橘病毒病害每年都會對世界柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。柑橘黃化脈明病毒(Citrus yellow clearing vein virus,CYVCV)作為2009年我國發(fā)現(xiàn)侵染柑橘的一種新病毒,會引起檸檬和酸橙嫩葉脈明、黃化、葉片反卷和皺縮等癥狀,嚴(yán)重時可導(dǎo)致嫩葉脫落、葉脈壞死,造成樹勢衰弱、果實(shí)產(chǎn)量下降,有時甚至絕收;近幾年,該病毒在我國柑橘產(chǎn)區(qū)的發(fā)生呈現(xiàn)逐年上升趨勢,已經(jīng)成為影響我國柑橘產(chǎn)業(yè)尤其是檸檬產(chǎn)業(yè)的一個重要問題。柑橘葉斑駁病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)是乙型線形病毒科(Betaflexiviridae)柑橘病毒屬(Citrivirus)的代表成員,可侵染大多數(shù)的柑橘品種,中國于2016年在甜櫻桃和獼猴桃上首次發(fā)現(xiàn),后續(xù)在檸檬上也有報道。目前對CYVCV和CLBV的分子特性和生物學(xué)特性研究較少,而植物病毒侵染性克隆是研究病毒基因功能的重要工具。然而利用大腸桿菌構(gòu)建基因組較大的病毒全長侵染性克隆時,會出現(xiàn)基因組結(jié)構(gòu)(突變及缺失)不穩(wěn)定的現(xiàn)象。因此本研究首先分別對CYVCV和CLBV分離物進(jìn)行了全長cDNA的擴(kuò)增,然后通過基于酵母轉(zhuǎn)化的同源重組(transformation-associated recombination,TAR)技術(shù)分別成功構(gòu)建了CYVCV和CLBV的基因組全長侵染性克隆,為進(jìn)一步研究兩種病毒的分子生物學(xué)特性、致病機(jī)理及其載體化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。所取得的主要研究結(jié)果如下:1、病毒侵染性克隆的快速構(gòu)建體系本研究利用In-Fusion HD Cloning Kit重組連接雙元載體DK1317-2骨架和含有酵母相關(guān)復(fù)制起始位點(diǎn)的片段pYES1L-2117,得到可以在酵母-農(nóng)桿菌-大腸桿菌中復(fù)制和表達(dá)的三元穿梭載體pCY(Genbank登錄號:MG637043);進(jìn)而建立了基于pCY及TAR技術(shù)的快速克隆體系,然后利用Potato Virus X(PVX)對該體系進(jìn)行驗證,在2周內(nèi)獲得了PVX侵染性克隆。2、CYVCV侵染性克隆構(gòu)建本研究建立了CYVCV基因組的一步法RT-PCR擴(kuò)增體系;通過TAR技術(shù)克隆至三元載體pCY,成功獲得柑橘黃化脈明病毒四川安岳分離物基因組全長cDNA克隆,測序結(jié)果表明CYVCV-AY基因組為7529 bp,包含6個開放閱讀框,與目前已報道的CYVCV分離株一致。選取一致序列進(jìn)行提交并命名為:CYVCV-AY(Genbank登錄號:MG878869);序列比對結(jié)果顯示,隨機(jī)選取的4個CYVCV-AY基因組全長cDNA克隆的核苷酸序列相似性均在99%以上;在系統(tǒng)進(jìn)化樹上,CYVCV-AY的4個克隆均與柑橘來源的CYVCV分離株聚為一簇。通過TAR克隆在國內(nèi)外首次獲得了CYVCV的侵染性cDNA克隆,癥狀觀察及RT-PCR檢測結(jié)果表明,所獲得的pCY-CYVCV具有侵染性。農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種試驗表明,接種方式和所選取的寄主對侵染效率有較大影響;所獲得的pCY-CYVCV全長cDNA采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空浸潤柑橘,其侵染效率比較高。3、CLBV侵染性克隆構(gòu)建利用所建立的柑橘病毒侵染性克隆的快速構(gòu)建體系,首次獲得了CLBV中國分離株的侵染性克隆HBYD(Genbank登錄號:MG572236)。序列測定顯示,CLBV-HBYD基因組長度及結(jié)構(gòu)與目前已報道的來自柑橘的CLBV分離株一致,為8747 bp,包含3個開放閱讀框,ORF1為5889 nt、ORF2為1089 nt、ORF3為1092 nt,5′端有甲基化帽子結(jié)構(gòu),3′末端具有poly(A)。全基因組序列比對顯示,CLBV-HBYD與已登錄的9個CLBV分離物的核酸序列一致性在79%~98%,其中與柑橘來源的EU857540一致性最高為98%,與獼猴桃來源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均為79%。在系統(tǒng)進(jìn)化樹上,MG572236與柑橘來源的CLBV分離株聚為一簇。在侵染性克隆的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了插入亞基因組啟動子及GFP基因開放讀碼框的pCLBV表達(dá)載體。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S436.66
【部分圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述第一章 文獻(xiàn)綜述 柑橘黃化脈明病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）研展1 發(fā)生與分布由柑橘黃化脈明病毒（CYVCV）引起的柑橘黃化脈明病，是一種新發(fā)現(xiàn)的柑橘病毒病害。最早是 1988 年在巴基斯坦的檸檬和酸橙上發(fā)現(xiàn)[1, 2]，其病毒會引起檸檬和酸橙出現(xiàn)嫩葉、黃化、葉片反卷和皺縮等癥狀（圖 1），嚴(yán)重時可導(dǎo)致嫩葉脫落、葉脈壞死，造成樹勢、果實(shí)產(chǎn)量下降、有時甚至絕收。1996 年 Grimaldi 和 Catara 在出現(xiàn)黃化脈明癥狀的檸片上觀察到一種纖維狀病毒粒體，隨后在印度的香櫞、酸橙和檸檬等不同品種上也被觀[3]，并在巴基斯坦[4]、土耳其[5]迅速蔓延。中國于 2009 年在云南瑞麗檸檬上首次發(fā)現(xiàn)[6, 7]，在重慶、四川、江西等地也相繼發(fā)現(xiàn)該病[8-10]。

圖 1.2 CYVCV-Y1 的病毒粒子結(jié)構(gòu)圖tained particles of citrus yellow vein clearing virus (CYVCV單鏈 RNA 病毒，CYVCV 的基因結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定性產(chǎn)生較大變異[12]，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的基因組有兩種類型，一種為酸，包含 5′和 3′端非編碼區(qū)（UTR）、6 個開放閱讀框（Op）尾巴(圖 3)。CYVCV 的 6 個開放閱讀框都起始于 A TGA（ORF2、3、6）。其中，RNA 依賴的 RNA 聚合的保守結(jié)構(gòu)域由 ORF1 編碼；ORF2、ORF3 和 ORF4 組locks, TGB)，分別編碼病毒在植物中的運(yùn)動相關(guān)蛋白 TGa 的蛋白，其中包含一個大的病毒解旋酶結(jié)構(gòu)域、一個 化基團(tuán)；TGB2 是一個 12k Da 的蛋白，包含一段植物病r family）的保守結(jié)構(gòu)域，TGB3 是一個 6.4 k Da 的蛋白，鈴薯 X 病毒屬“7kDa 的病毒外殼蛋白”保守結(jié)構(gòu)域的Coat protein, CP），包含一個柑橘病毒屬的保守結(jié)構(gòu)域；

圖 1.3 CYVCV 的 RNA 基因組結(jié)構(gòu)圖REP：復(fù)制相關(guān)蛋白；M：病毒甲基轉(zhuǎn)移酶；A：AlkB 蛋白區(qū)域；H：病毒解旋酶；R：依賴 RNA 的 RNA聚合酶；TGB：三基因盒；CP：外殼蛋白；23K：23kDa 蛋白Fig. 1.3 Schematic representation of the RNA genome of Citrus yellow vein clearing virusCYVCVREP: Replication-associated polyproteins; M: Viral methyltransferase domain; A: AlkB-like domain; H: Viralhelicase domain; R: RNA-dependent RNA polymerase 2 domain; TGB: Triple gene block; CP: Coat protein; 23K:Encoded putative protein of 23 kDa寄主范圍及傳播途徑CYVCV 寄主比較廣泛，可通過嫁接在大多數(shù)柑橘品種間傳播，但僅在檸檬、酸橙、香櫞等柑橘品種上表現(xiàn)典型的黃化脈明癥狀[13]。CYVCV 侵染林娜臍橙（C .sinensis）及其他少數(shù)品種柑橘后，會導(dǎo)致葉片上輕微的斑點(diǎn)和類似環(huán)斑等癥狀[2]。但是，CYVCV 侵染墨西哥萊檬（C. aurantifolia）、葡萄柚（C. paradis）及少量寬皮柑橘（C.reticulata）等品種柑橘上并不表現(xiàn)癥狀[11]。CYVCV 還能通過摩擦接種的方式感染菜豆（P. vulgaris）、豇豆（V. unguiculata）、1.1.3
【參考文獻(xiàn)】

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4 趙光遠(yuǎn);庹德財;沈文濤;黎小瑛;周鵬;;海南番木瓜環(huán)斑病毒全長cDNA克隆及其侵染性克隆構(gòu)建[J];熱帶作物學(xué)報;2015年05期

5 倪現(xiàn)樸;季州翔;夏煥章;;同源重組方法在制備DNA大片段中的應(yīng)用[J];沈陽藥科大學(xué)學(xué)報;2014年08期

6 周常勇;王雪峰;周彥;劉金香;;我國柑桔病毒病發(fā)生和防控進(jìn)展[J];中國果業(yè)信息;2013年10期

7 周彥;周常勇;李中安;王雪峰;劉科宏;;利用弱毒株交叉保護(hù)技術(shù)防治甜橙莖陷點(diǎn)型衰退病[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年12期

8 歐陽平;李玉;嚴(yán)紅;馬立新;;一種載體構(gòu)建的新方法:一步克隆法[J];湖北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2007年02期

9 葉劍;青玲;周雪平;;與中國番茄黃化曲葉病毒伴隨的DNAβ分子βC1缺失突變體介導(dǎo)的交叉保護(hù)作用初步研究[J];浙江大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版);2006年05期

10 曹云鶴;原雪峰;王曉星;郭立華;蔡祝南;韓成貴;李大偉;于嘉林;;甜菜黑色焦枯病毒外殼蛋白與病毒致病性的關(guān)系[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2006年02期

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2 宋震;柑橘碎葉病毒侵染性克隆構(gòu)建及其誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）體系建立[D];西南大學(xué);2013年

3 高瑞;煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構(gòu)建及其在交叉保護(hù)、外源蛋白表達(dá)及VIGS中的應(yīng)用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 董家紅;小麥黃花葉病毒侵染性cDNA克隆及細(xì)胞侵染體系的建立[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

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本文編號：2842152