Penicillium expansum是蘋果采后青霉病害的主要病原菌。青霉病害的發(fā)生不僅造成采后蘋果巨大經(jīng)濟損失,而且P.expansum分泌產(chǎn)生的次生代謝物棒曲霉素(patulin)有致畸、致癌和免疫毒性,威脅人類健康。盡管已有不少控制蘋果青霉腐爛病害的報道,但對P.expansum侵染過程和機理的研究鮮有報道。本論文主要是在宿主植物組織誘導(dǎo)物存在條件下,利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和分泌蛋白組學(xué)方法對P.expansum基因和分泌蛋白的表達情況進行差異分析,發(fā)掘候選致病效應(yīng)子,進而探究P.expansum侵染機制,為防控蘋果采后青霉腐爛病害提供新策略。研究獲得的具體成果及結(jié)論如下:1、轉(zhuǎn)錄組(RNA-Seq)分析顯示,與對照(察氏培養(yǎng)基)相比,宿主植物組織培養(yǎng)基(蘋果汁)中培養(yǎng)的P.expansum在24 h有3786個基因、72 h有4840個基因上調(diào)表達(p≤0.05),GO注釋分類顯示差異基因涉及23類生物學(xué)過程(biological process,BP),15類細胞組分(cellular component,CC)和14類分子功能(molecular function,MF),富集程度較高的亞類包括細胞(cell)、結(jié)合(binding)和催化活性(catalytic activity)等。KOG功能分析,上調(diào)表達基因涉及的22類主要包括脂質(zhì)運輸,代謝(lipid transport and metabolism)、次級代謝產(chǎn)物的生物合成,轉(zhuǎn)運,分解代謝(secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism)和通用功能預(yù)測(general function prediction only)等。上調(diào)表達基因信號肽掃描分析,鑒定其中的550個(24 h)和727個(72 h)為分泌蛋白的編碼基因。隨機挑選13個上調(diào)表達基因進行qRT-PCR驗證,基因表達豐度變化與RNA-Seq分析結(jié)果基本一致。2、利用HPLC-MS/MS技術(shù)對蘋果汁培養(yǎng)基中P.expansum的胞外分泌蛋白進行分析鑒定,共鑒定出166個(24 h)和272個(72 h)胞外分泌蛋白,其中功能已知的分泌蛋白與RNA-Seq信號肽預(yù)測的分泌蛋白數(shù)據(jù)基本吻合。鑒定得到的胞外分泌蛋白其主要包括與碳水化合物代謝、次生代謝等相關(guān)蛋白及一部分功能未知的蛋白。3、結(jié)合RNA-Seq數(shù)據(jù)與分泌蛋白組數(shù)據(jù)選擇PEX1_069590(Lipase,class 3)、PEX1_031490(Peptidase aspartic,catalytic)和PEX1_048740(Peptidase S10,serine carboxypeptidase)基因作為候選效應(yīng)子進行生化和分子水平功能分析;結(jié)果顯示,在三種酶特異性抑制劑存在條件下,P.expansum侵染和青霉病害的發(fā)生受到明顯抑制,表明這三個基因在P.expansum侵染過程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S436.611.19
【部分圖文】：

圖 2.1 P. expansum 的生長和毒素積累Fig. 2.1 The growth and patulin accumulation of P. expansumA：菌體生長量；B：棒曲霉素含量2.4.2 樣品 RNA 提取質(zhì)量檢測利用 Nanodrop2000 微量紫外可見分光光度計對提取的 RNA 進行濃度和質(zhì)量分析（表 2.2）。檢測結(jié)果顯示提取的樣品 RNA 濃度均>250 ng/μL，OD260/280值均在 1.8-2.2 之間，OD260/230值均≥1.0，表明提取的樣品 RNA 純度較高、能滿足后續(xù) RNA-Seq 的要求和建庫標準。利用 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對樣品 RNA純度檢測結(jié)果表示，RNA 條帶清晰，RNA 的完整性較好（圖 2.2）。表 2.2 樣品 RNA 濃度檢測結(jié)果Table 2.2 The concentration test of sample RNA樣品名 濃度（ng/μL） OD260/OD280OD260/OD230

圖 2.2 樣品 RNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果Fig. 2.2Agarose gel electrophoresis of sample RNA別代表蘋果汁和察氏培養(yǎng)基，24 和 72 代表培養(yǎng)時間（h據(jù)統(tǒng)計結(jié)果eq 的各個樣品的原始測序片段均大于 6.57 Gb，測差異基因表達明顯而豐度不足的情況。各樣品的 Q1%的比例均達到 95.4%以上，GC 含量在 54.26%至測序質(zhì)量均較好，且樣本基因覆蓋率在 90%-100%（表 2.3，2.4）。表 2.3 RNA-Seq 數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果Table 2.3 The data statistics of transcriptome sequencing序片段（G） 高質(zhì)量序列 序列平均長度 Q30/%

圖 2.3 差異基因表達情況統(tǒng)計Fig 2.3 Differential gene expression statistics基因 GO 注釋分析據(jù)庫對 P. expansum 孢子在蘋果汁培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h、40 個差異基因進行 GO 注釋分類分析（圖 2.4）。GO biological process，BP）、細胞組分（cellular compomolecular function，MF）三大類。培養(yǎng) 24 h 時，注釋生物學(xué)過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（M別是 39.3%，41.2%，19.5%。培養(yǎng) 72 h 時，上調(diào)表達比 41.4%，40.2%，18.4%。學(xué)過程（BP）主要包含 23 個亞類，24 h、72 h 基因胞過程（cellular process）、代謝過程（metabolic pr

【參考文獻】

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本文編號：2824674