miR319是一種保守的miRNA,已有研究發(fā)現(xiàn)它參與植物的生長發(fā)育、對干旱、寒冷及鹽脅迫的應答,但在真菌脅迫應答方面的研究幾乎沒有。本實驗旨在利用生物學實驗方法研究植物miR319c及其靶基因在灰霉菌侵染植物過程中的生物學功能。得到的主要實驗結(jié)果總結(jié)如下:(1)RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn),miR319c在感染灰霉菌的番茄中表達下調(diào),靶基因TCP24和TCP29的表達上調(diào),說明miR319c可能通過調(diào)節(jié)靶基因參與番茄葉片對灰霉菌感染的響應。(2)在轉(zhuǎn)基因擬南芥和轉(zhuǎn)基因番茄中,miR319c得到了過量表達,相應地,其5個TCP家族成員的靶基因表達顯著下降。(3)接菌實驗證實,過表達miR319c的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片和轉(zhuǎn)基因番茄葉片沒有明顯的病斑,臺盼藍染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)灰霉菌菌絲在過表達miR319c的植株相比于各自的野生型明顯受到抑制,說明miR319c的過表達增強了轉(zhuǎn)基因植株對灰霉菌的抗性。(4)基于過表達miR319c轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)的抗性,本研究對茉莉酸(JA)合成和信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因、miRNA合成過程關(guān)鍵基因以及一些脅迫應答相關(guān)miRNA的表達進行了RT-qPCR檢測。其中,JA合成和信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因表達大多數(shù)都呈上調(diào),可能JA響應灰霉菌的誘導從而激活下游相關(guān)防御反應;另外,實驗結(jié)果顯示植物響應脅迫相關(guān)miRNAs的表達受miR319c過表達的影響;miR319c的過表達或者灰霉菌的侵染對miRNA合成途徑主要基因的表達沒有明顯的影響。(5)基于RNAi技術(shù)和過表達手段,構(gòu)建了miR319靶基因TCP的RNAi載體和過表達載體,并導入擬南芥�？傊�,本實驗成功獲得了ath-miR319c過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥和番茄植株,揭示了miR319c的過表達增強了轉(zhuǎn)基因植株對灰霉菌的抗性。
【學位單位】：浙江理工大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S436.412
【部分圖文】：

浙江理工大學碩士學位論文 番茄miR319c對灰霉病菌侵染的應答及其功能研究的CT值-內(nèi)參的CT 值）灰霉菌處理組（-所需檢測基因的 CT 值-內(nèi)參的 CT 值）對照組[66]。2.8 MiR319 過表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生2.8.1 過表達載體的構(gòu)建為了進一步研究 miR319c 在植物適應非生物脅迫或生物脅迫中發(fā)揮作用的機制，本實驗構(gòu)建了 miR319c 過表達載體，含有 miR319c 前體（pre-athmiR319c）的擬南芥互補 DNA（cDNA）被擴增，然后克隆到表達載體 pBIN438，產(chǎn)生ath-miR319c 過表達基因構(gòu)建體，p35S-athmiR319c / p35S-Km。如圖 1 所示，ath-premiR319c 基因處于 CaMV 35S 啟動子下游。

第三章 實驗結(jié)果1 灰霉菌侵染后番茄葉片的分子檢測1.1 MIR319c 在灰霉菌侵染的番茄葉片表達變化先前的研究表明 miR319 與一些非生物脅迫（干旱、鹽、寒冷、氮缺乏）有關(guān)，此外，本實驗室之前在感染灰霉菌 7d 的番茄（金棚 1 號）葉片中進行高通量分析，研究響應灰霉菌脅迫的 sRNA，結(jié)果顯示 miR319 由灰霉菌感染誘導[54]。為了研究灰霉菌侵染番茄后 miR319c 的響應模式和作用機制，本實驗在感染了灰霉菌的番茄（microTom）葉片內(nèi)檢測 miR319c 的表達水平和表達動態(tài)（microTom 是模式植物，生長周期短，個體小，做轉(zhuǎn)基因相對容易）。RT-qPCR結(jié)果表示，在感染了灰霉菌的番茄葉片內(nèi)，隨著侵染時間的推移，miR319c 的表達也在發(fā)生變化。本實驗結(jié)果顯示初級轉(zhuǎn)錄本的表達趨勢顯示上調(diào)；前體的表達趨勢顯示下調(diào)，miR319c 表達下調(diào)。

圖 3 miR319c 在番茄中的靶基因 TCP24 和 TCP29 在感染灰霉菌的番茄葉片內(nèi)的動2 過表達 MiR319c 轉(zhuǎn)基因擬南芥分子分析2.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性鑒定2.1.1 Kan 基因的擴增為了篩選含有 miR319c 過表達構(gòu)建體的陽性轉(zhuǎn)基因植物，本實驗以和轉(zhuǎn)基因型的擬南芥基因組為 PCR 模板，擴增 Kan 基因并鑒定出 13 個陽因株系。如圖所示，13 個 line 的基因組中均擴增出了 Kan 基因，說明過體已經(jīng)在擬南芥中成功表達。圖 4 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片內(nèi) Kan 基因的擴增

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本文編號：2824612