昆蟲在長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中形成一套完整的免疫系統(tǒng),即先天免疫系統(tǒng),來(lái)抵御微生物的感染。昆蟲的先天免疫主要依靠模式識(shí)別受體來(lái)識(shí)別病原菌的病原體相關(guān)分子模式,而這些病原體相關(guān)分子模式只存在于微生物而不存在宿主中,例如:脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸等。其中肽聚糖識(shí)別蛋白作為一種重要的模式識(shí)別受體能識(shí)別病原微生物細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖。迄今為止,對(duì)于果蠅肽聚糖識(shí)別蛋白的研究較為透徹,而對(duì)于家蠶肽聚糖識(shí)別蛋白的研究較少。本論文主要對(duì)家蠶的肽聚糖識(shí)別蛋白,即BmPGRP-S1和BmPGRP-S4,進(jìn)行了比較全面的研究,研究結(jié)果如下:1.運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)BmPGRP-S1和BmPGRP-S4基因進(jìn)行分析,確定這兩種基因的序列號(hào)分別為NM-001043371,XM-004928822。分別編碼196和199個(gè)氨基酸,且都有信號(hào)肽和一個(gè)保守的PGRP結(jié)構(gòu)域,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。通過(guò)序列比對(duì)和構(gòu)建進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因在昆蟲中是高度保守的。通過(guò)熒光定量PCR技術(shù),對(duì)BmPGRP-S1和BmPGRP-S4在家蠶不同發(fā)育時(shí)期和組織器官中進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn),BmPGRP-S1主要在5齡幼蟲和脂肪體中表達(dá),而BmPGRP-S4主要在家蠶早期幼蟲和血淋巴中表達(dá)。2.利用HE染色技術(shù)對(duì)感染細(xì)菌的家蠶中腸組織進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)隨著感染細(xì)菌時(shí)間的延長(zhǎng),其中腸組織逐漸發(fā)生病變,表現(xiàn)為細(xì)胞核增大并逐漸脫落,中腸組織發(fā)生斷裂,直至中腸組織聚集成團(tuán),無(wú)完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn),最終導(dǎo)致家蠶死亡。利用免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在細(xì)菌感染下,BmPGRP-S1蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中,并均勻分布在整個(gè)腸腔。3.采用熒光定量PCR的方法研究基因在轉(zhuǎn)錄水平上的變化。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),細(xì)菌感染家蠶后,誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因(Imd和Toll通路相關(guān)基因和抗菌肽基因)以及BmPGRP-S1和BmPGRP-S4的表達(dá)。BmPGRP-S1參與家蠶的先天免疫過(guò)程,并且在不同的組織中由細(xì)菌誘導(dǎo)其表達(dá)量明顯不同;同時(shí)對(duì)于同一組織,由于對(duì)不同微生物的敏感性不同導(dǎo)致BmPGRP-S1的表達(dá)量也有所差異。BmPGRP-S4主要表達(dá)于血淋巴中以響應(yīng)細(xì)菌的感染,但當(dāng)家蠶感染大腸桿菌時(shí),與感染其它細(xì)菌相比,BmPGRP-S4表達(dá)量無(wú)明顯變化。4.采用雙熒光素酶報(bào)告基因的方法,將5種抗菌肽基因啟動(dòng)子構(gòu)建到PGL3載體上,通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性來(lái)檢測(cè)啟動(dòng)子活性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),BmPGRP-S1和BmPGRP-S4蛋白對(duì)抗菌肽的啟動(dòng)子具有激活作用,這表明BmPGRP-S1和BmPGRP-S4蛋白可以激活抗菌肽基因的表達(dá)。5.利用RNA干擾技術(shù)在家蠶蠶體和中腸組織中成功敲低BmPGRP-S1的表達(dá),在血淋巴中成功敲低BmPGRP-S4的表達(dá)。結(jié)果表明,在家蠶蠶體和中腸組織中,對(duì)BmPGRP-S1進(jìn)行RNA干擾后,CecA、Glv1、Leb3、Mor這4種抗菌肽基因的表達(dá)明顯降低,同時(shí)參與Imd通路中的Dredd和FADD基因表達(dá)量的降低,而對(duì)于參與Toll通路中的Myd88和Tube基因的表達(dá)量無(wú)影響。由此推測(cè),在中腸組織中,BmPGRP-S1蛋白參與家蠶先天免疫中Imd通路的激活,并通過(guò)激活I(lǐng)md通路產(chǎn)生抗菌肽,從而殺死入侵的細(xì)菌。在家蠶血淋巴組織中,對(duì)BmPGRP-S4進(jìn)行RNA干擾后,導(dǎo)致CecA、Leb3、Mor這3種抗菌肽基因的表達(dá)明顯增加,同時(shí)參與Imd通路中的FADD基因表達(dá)量的升高,而對(duì)于參與Toll通路中的Pelle和Tube基因的表達(dá)量無(wú)影響。由此推測(cè),BmPGRP-S4蛋白可能對(duì)Imd通路起抑制作用,并通過(guò)抑制Imd通路的激活抑制抗菌肽表達(dá),從而防止Imd通路的過(guò)度激活以損害宿主。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S881.2
【部分圖文】：

氨基庚二酸型（DAP 型）和 L-賴氨酸型（Lys 型）。大多數(shù)的革蘭氏陰性菌肽聚糖是 DAP 型，能夠激活 Imd 通路產(chǎn)生抗菌肽，而大多數(shù)的革蘭氏陽(yáng)性菌肽聚糖是 Lys 型，則是通過(guò)激活 Toll 通路產(chǎn)生抗菌肽[18]。通過(guò)構(gòu)建 PGRP 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn) PGRP 在進(jìn)化上具有高度的保守性。所有的 PGRPs 都含有保守的大約為 160 個(gè)氨基酸殘基的 PGRP 結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域與 T7 溶菌酶（T7 lysozyme）有 30%的相似性,具有酰胺酶活性(如圖 1.1)，在Zn2+存在下可以結(jié)合并裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖（如圖 1.2）。但一些PGRPs 由于缺少酰胺酶活性的關(guān)鍵氨基酸殘基而沒(méi)有酰胺酶活性，其中 PGRPs存在 5 個(gè)酰胺酶活性所必須的關(guān)鍵氨基酸殘基。根據(jù) PGRPs 是否具有酰胺酶活性將其分為兩種類型，催化型 PGRPs 和非催化型 PGRPs[19]。催化型 PGRPs 主要位于胞外，一般作為殺菌劑或起調(diào)節(jié)免疫通路的作用，防止免疫通路的過(guò)度激活。非催化型 PGRPs 位于胞內(nèi)、跨膜或胞外，可能獲得了激活水解酶的特性或起到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用甚至可以增強(qiáng)免疫通路的激活（如圖 1.3）。

圖 1.2 DAP 型肽聚糖結(jié)構(gòu)及裂解的位點(diǎn)Figure 1.2 DAP-type peptidoglycan structure and cleavage site

3圖 1.3 果蠅長(zhǎng)型和短型 PGRPs 模式圖Figure 1.3 Long and Short PGRPs Patterns of Drosophila melanogaster所有 PGRPs 都存在一個(gè)保守的 L 形 PGN 結(jié)合槽，該 PGN 結(jié)合槽含有 30至 50 個(gè)殘基的 N-末端片段。通過(guò)分析果蠅 PGRP-LB 結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在 PGN 結(jié)合槽

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 任菲菲;曹方;楊婉瑩;;昆蟲先天免疫中的肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRP)[J];廣東蠶業(yè);2014年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 張曉龍;家蠶二分濃核病毒感染的家蠶連續(xù)病理變化研究[D];江蘇大學(xué);2016年

2 趙鑫鑫;MyD88在中國(guó)鹵蟲不同發(fā)育時(shí)期及在革蘭氏菌刺激下的表達(dá)模式[D];遼寧師范大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2823714