狹葉坡壘Hopea chinesis Hand.-Mazz.是國家一級瀕危保護植物,因其抗病蟲害,是天然的防腐木。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)其不同萃取層粗提物對香蕉枯萎病Fusarium oxysporum f.sp.等21種植物病原菌有較好的抑菌活性,分離并鑒定了 15個化合物。目前尚未有狹葉坡壘內(nèi)生真菌的研究報道。本研究采用無菌技術(shù)對狹葉坡壘枝葉內(nèi)生真菌進行分離,結(jié)合形態(tài)學(xué)、ITS序列和真菌系統(tǒng)發(fā)育樹分析法對內(nèi)生真菌進行鑒定,以7種植物病原真菌為靶標,對分離得到的8株內(nèi)生真菌進行抑菌活性篩選,對高活性菌株進行了初步活性研究,并對其次生代謝產(chǎn)物進行部分分離。主要研究結(jié)果如下:1、采用組織塊培養(yǎng)法從狹葉坡壘枝葉中分離得到了 8株內(nèi)生真菌。采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法對菌株H.1、H.2、H.3、H.4、H.5、H.6、H.7、H.8進行鑒定,分離得到的內(nèi)生真菌分屬于2個亞門,2個綱,5個目,6個科,6個屬,H.1和H.2分別鑒定為擬莖點霉屬的Phomopsis sp.(NCBI登錄號為 KF159989.1)和 Phomopsis sp.(NCBI 登錄號為 KU512713.1),H.3 鑒定為炭角菌屬的Valsaceaesp.(NCBI登錄號為AB334109.1),H.4鑒定為色二孢屬的LasiodipLodia pseudotheobromae(NCBI 登錄號為 KY052959.1),H.5鑒定為鐮孢菌屬的Fusarium incarnatum(NCBI登錄號為KF255423.1),H.6鑒定為毛殼菌屬的Chaetomiumsp.C36(NCBI登錄號為JQ936193.1),H.7鑒定為囊孢殼屬的Physalospora sp.strain F1080(NCBI登錄號為KU747723.1),H.8鑒定為炭角菌屬的Xylariasp.F14(NCBI登錄號為KF675758.1)。2、采用平板對峙法測定了 8株內(nèi)生真菌對香蕉枯萎病菌4號小種Fusarium.oxysoporum Race 4、香蕉炭疽病菌Colletotrichum musae、香蕉大灰斑病菌Curvularia lunata、番茄早疫病菌Alternaria solani、煙草灰霉病菌Botrytis cinerea、煙草赤星病Alternaria alternata、柑橘黑斑(星)病菌Phoma citricarpa等7種植物病原真菌的抑菌活性,結(jié)果表明,菌株H.2、H.3、H.4和H.8對供試的不同植物病原菌具有抑菌活性,其中H.2、H.3、H.4和H.8均對煙草灰霉病菌表現(xiàn)出明顯的抑菌活性,H.4和H.8均對番茄早疫病菌表現(xiàn)出明顯的抑菌活性,H.3和H.8分別對香蕉炭疽病菌和柑橘黑斑(星)病菌表現(xiàn)出明顯的抑菌活性。3、采用菌絲生長速率法測定了菌株H.2、H.3、H.4、H.8發(fā)酵液對煙草灰霉病菌等7種植物病原真菌的抑菌活性,結(jié)果表明,菌株H.4發(fā)酵液對煙草灰霉病菌的抑制率僅為13.10%。菌株H.2、H.8發(fā)酵液對供試的病原真菌的抑制作用不顯著。菌株H.3發(fā)酵液對煙草灰霉病菌、柑橘黑斑(星)病菌和香蕉枯萎病菌的抑制作用顯著,抑制率分別為82.34%、49.80%和42.98%。進一步測定了菌株H.3不同發(fā)酵周期發(fā)酵液對煙草灰霉病菌的抑制作用,結(jié)果表明,發(fā)酵周期在5至20天內(nèi),發(fā)酵液對煙草灰霉病菌的抑制作用呈現(xiàn)隨著發(fā)酵周期變長而增強的趨勢,其中14、17和20天的抑制作用達到最強,抑制率分別達到80.87%、83.11%和84.46%,且三者間差異不顯著,證明了菌株H.3發(fā)酵液中起抑菌活性的物質(zhì)在14天后趨于穩(wěn)定。4、采用菌絲生長速率法測定了菌株H.3發(fā)酵液不同萃取層對煙草灰霉病菌的抑菌活性,結(jié)果表明,其發(fā)酵液中抑菌活性主要表現(xiàn)在乙酸乙酯萃取層和氯仿萃取層,抑制率分別為61.40%和29.37%,說明菌株H.3發(fā)酵液中起抑制煙草灰霉病菌的活性次生代謝產(chǎn)物主要集中在乙酸乙酯萃取層。并進一步探究了乙酸乙酯萃取層對煙草灰霉病菌的毒力,結(jié)果表明,乙酸乙酯萃取層對煙草灰霉病菌的抑制作用顯著高于對照藥劑,EC50值為440.64 mg/L。5、探究菌株H.3液體發(fā)酵最適條件實驗結(jié)果表明,菌株H.3的擴大培養(yǎng)條件是用改良的PYG作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基,置于28℃,160rpm的搖床內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)16天。收集發(fā)酵液后綜合運用硅膠柱層析、薄層色譜、凝膠Sephadex LH-20柱層析等分離技術(shù),對煙草灰霉病菌抑制作用最好的乙酸乙酯萃取層次生代謝產(chǎn)物進行部分分離,分離得到了2個化合物,化合物1鑒定為β-谷甾醇(β-sitosterol),化合物2待鑒定。本研究首次對狹葉坡壘枝葉內(nèi)生真菌進行分離,并以植物病原真菌為靶標進行抑菌活性篩選,結(jié)果表明,分離得到的內(nèi)生真菌及其發(fā)酵液對植物病原真菌具有良好的抑菌活性,是潛在的微生物農(nóng)藥活性次生代謝產(chǎn)物庫,其中菌株H.3發(fā)酵液乙酸乙酯萃取層次生代謝產(chǎn)物有作為煙草灰霉病菌抑菌劑開發(fā)的潛力。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S476
【部分圖文】：

邐狹葉坡轟枝葉內(nèi)生真菌的分商、答定及其抑菌活性初步研究逡逑１．６．２主要內(nèi)容逡逑本論文研宄路線見圖１－６，主要內(nèi)容包括：（１）狹葉坡壘枝葉植物組織內(nèi)生真菌的逡逑分離純化；（２）初篩：內(nèi)生真菌活性菌株的篩選，利用內(nèi)生真菌對植物病原真菌進行逡逑以菌抑菌活性實驗，篩選出具有較好抑菌活性的內(nèi)生真菌菌株；（３）內(nèi)生真菌的鑒定；逡逑（４）復(fù)篩：活性內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抑菌活性測定及發(fā)酵特性的記錄；（５）活性菌株發(fā)逡逑酵條件的優(yōu)化；（６）活性菌株擴大發(fā)酵培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物的提��；（７）發(fā)酵產(chǎn)物的分離，逡逑鑒定純化的化合物結(jié)構(gòu)。逡逑狹葉坡壘逡逑各逡逑內(nèi)生真菌逡逑Ｉ邋邐逡逑內(nèi)生真菌分離纟中化及擱定逡逑生物活性篩迭逡逑Ｉ逡逑發(fā)酵條件初探逡逑發(fā)酵產(chǎn)物及菌絲體提取物逡逑ｉ逡逑提取物分離及嫠定，得到單體逡逑化合物逡逑圖１－６研宄路線逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－

廣西大學(xué)碩士掌位論文邐狹葉坡壟＿枝葉內(nèi)生真菌的分

本文編號：2823499