油菜作為世界上種植最為廣泛的油料作物之一,是人類食用油和畜牧飼料的主要來源,但是在油菜的整個生育期內(nèi)會面臨很多生物脅迫和非生物脅迫,嚴重影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。研究表明,轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達,在植物脅迫應(yīng)答中起關(guān)鍵性作用。其中ERF轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于各類植物中,許多研究也表明在植物中過量表達ERF轉(zhuǎn)錄因子,可以激活下游相關(guān)抗性基因的表達,來提高植物的抗逆性和抗病性。本實驗根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果-黑脛病菌(Leptosphaeria biglobosa)誘導(dǎo)甘藍型油菜葉片4 d后,表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子BnERF019,對該基因進行表達分析和功能鑒定,得出如下結(jié)論:1.以油菜真葉接種Leptosphaeria biglobosa 4 d后提取RNA,反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,克隆得到Bn ERF019轉(zhuǎn)錄因子的CDS序列,測序后該轉(zhuǎn)錄因子CDS序列為453 bp,與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中的序列(ID=Bna C07g13470D)進行比對,100%一致。利用CLC sequence viewer 6.0推導(dǎo)BnERF019基因編碼蛋白的氨基酸序列,編碼151個氨基酸,分子量為16.38 KD,理論等電點為6.27,并預(yù)測其蛋白二級結(jié)構(gòu)、磷酸化位點、跨膜結(jié)構(gòu)和親疏水性。2.基于實時熒光定量PCR分析接種黑脛病菌4 d、5 d和6 d后的油菜根、莖、葉的相對表達量。結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)錄因子在油菜的根、莖、葉中均有表達。在接種黑脛病菌4 d,5 d和6 d基因都有表達。第5 d根莖中的相對表達量達到最高,第6 d葉中的相對表達量達到最高。說明Bn ERF019轉(zhuǎn)錄因子在油菜抗黑脛病(Leptosphaeriabiglobosa)中發(fā)揮著重要的作用。3.亞細胞定位結(jié)果表明,BnERF019蛋白集中分布在細胞核,而空載體p YBA-1132在細胞核、細胞質(zhì)和細胞膜中均有分布。4.為了驗證基因BnERF019的功能,構(gòu)建過表達載體pYBA-1143-ERF019,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染花序方法將重組質(zhì)粒pYBA-1143-ERF019轉(zhuǎn)入野生型擬南芥。經(jīng)過卡那霉素抗性篩選和PCR檢測鑒定后,獲得了T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥6株。5.轉(zhuǎn)基因擬南芥進行離體葉片接種法鑒定黑脛病抗性,結(jié)果表明,隨著接種黑脛病菌天數(shù)的延長,轉(zhuǎn)BnERF019基因的擬南芥與野生型擬南芥相比,葉片病斑面積明顯較小,腐爛程度也明顯較低。說明BnERF019顯著提高了對黑脛病菌的抗性,且Bn ERF019以正向調(diào)控方式參與植物的防御反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.654
【部分圖文】：

油菜葉片RNA電泳圖

ERF019PCR產(chǎn)物電泳圖

圖 3-3：BnERF019 基因序列比對結(jié)果Fig3-3：BnERF019 gene sequence alignment results2 生物信息學(xué)分析2.1BnERF019 氨基酸組成分析

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉詢;張斌;李浪;劉春林;阮穎;;甘藍型油菜BnaLCR23基因CRISPR-Cas9表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化[J];分子植物育種;2017年08期

2 潘宣丞;居超明;杜雪竹;;ERFs轉(zhuǎn)錄因子對植物生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)調(diào)控的研究[J];分子植物育種;2017年11期

3 王莎莎;趙洪春;鄧鳳飛;龔明;;小桐子中一個新的ERF家族轉(zhuǎn)錄因子JcERF3基因的克隆及功能分析[J];植物生理學(xué)報;2017年08期

4 高春艷;吳芮;袁玉;劉同s

本文編號：2823320