發(fā)布時間：2020-09-07 13:02

　　 由茄科雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病造成了世界范圍內(nèi)馬鈴薯產(chǎn)量的降低。大多數(shù)細(xì)菌病原體通過分泌效應(yīng)蛋白到植物細(xì)胞內(nèi)來操控植物免疫應(yīng)答反應(yīng)。由于效應(yīng)子是青枯病的重要致病因子,本課題旨在通過研究效應(yīng)子的基礎(chǔ)功能繼而探究馬鈴薯青枯病致病機(jī)理。本課題以馬鈴薯E3試管薯為受體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了效應(yīng)子Rip5、Rip6和Rip13的轉(zhuǎn)基因株系。探究效應(yīng)子轉(zhuǎn)入所影響的馬鈴薯免疫途徑,同時對效應(yīng)子轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了接種鑒定。并且對Rip6轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序,通過數(shù)據(jù)分析找到了與植物抗性有關(guān)的差異表達(dá)基因。由于Rip5毒力較強(qiáng)且在本氏煙葉片瞬時表達(dá)可以引起強(qiáng)烈的HR反應(yīng),為了深入研究Rip5的基因功能,酵母雜交實驗初步篩選了Rip5的候選互作蛋白,通過免疫共沉淀實驗確認(rèn)了互作蛋白。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究效應(yīng)子調(diào)控馬鈴薯免疫應(yīng)答機(jī)制奠定了良好基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.課題通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系獲得了Rip5、Rip6和Rip13轉(zhuǎn)基因株系。最終獲得Rip5、Rip6和Rip13生根株系分別為9、13和30個。通過陽性檢測,我們選取Rip5的轉(zhuǎn)基因株系4、5和7;Rip6的轉(zhuǎn)基因株系1、3、8和11;以及Rip13的轉(zhuǎn)基因株系11、14和25進(jìn)行后續(xù)試驗。2.對Rip5、Rip6和Rip13轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行優(yōu)勢菌株UW551接種鑒定。3個效應(yīng)子轉(zhuǎn)基因株系接種表型與對照E3相比抗性明顯下降,說明效應(yīng)子Rip5、Rip6和Rip13可以促進(jìn)青枯菌侵染寄主植物,降低植物抗性。3.對轉(zhuǎn)基因株系PTI免疫途徑標(biāo)志基因進(jìn)行表達(dá)量檢測,發(fā)現(xiàn)雖然轉(zhuǎn)基因株系接種抗性下降,但是PTI免疫途徑并未受到影響,說明效應(yīng)子基因的轉(zhuǎn)入可能影響了其他免疫途徑。4.對效應(yīng)子Rip6轉(zhuǎn)基因株系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)有大量鈣調(diào)蛋白、部分熱激蛋白和WRKY轉(zhuǎn)錄因子與對照相比差異表達(dá)。推測轉(zhuǎn)基因株系青枯菌抗性下降與這些基因的差異表達(dá)緊密相關(guān)。5.利用酵母雜交實驗初步篩選出Rip5的候選互作蛋白,在本氏煙葉片上對Rip5及互作蛋白進(jìn)行農(nóng)桿菌共注射瞬時表達(dá),通過免疫共沉淀實驗進(jìn)行植物體內(nèi)互作驗證。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S435.32
【部分圖文】：

23W551菌株基因組DNA中擴(kuò)增 Rip5、Rip6 和 R，條帶大小為 480 bp；泳道 2、3 對應(yīng)的是 Rip6 條帶道 4 對應(yīng)的是 Rip5 條帶，條帶大小為 840 bp。p6 and Rip13 amplified from genome DNAof Uip13 band, Rip13 is 480 bp; Lane 2,3 corresponds to the RLane 4 corresponds to the Rip5 band, Rip5 is 840 bp.

2 超量穩(wěn)定表達(dá)載體的構(gòu)建將以 UW551 基因組 DNA 為模板擴(kuò)增的效應(yīng)子片段通過同源重組連接到表達(dá)載體 pH7C-HA 載體上，構(gòu)建成 pH7C-Rip5、pH7C-Rip6 和 pH7C-Rip1表達(dá)載體，送測序驗證載體構(gòu)建正確。3 轉(zhuǎn)基因株系的獲得將構(gòu)建成功的 pH7C-Rip5, pH7C-Rip6 和 pH7C-HA-Rip13 載體質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌感受態(tài) LBA4404，以馬鈴薯品種 E3 的試管薯切片為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)獲得的抗性芽在含有潮霉素的抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行生根篩選，生根良好的株行后續(xù)陽性檢測，其中 Rip5、Rip6 和 Rip13 分別獲得 9 個、13 個和 30 個植株。

圖 6 效應(yīng)子轉(zhuǎn)基因株系 PCR 檢測泳道 M：Trans 2k DNA 標(biāo)記；E3 為陰性對照；各圖中數(shù)字表示效應(yīng)子不同的轉(zhuǎn)基因株系編號。A 代表效應(yīng)子 Rip5 條帶，B 代表效應(yīng)子 Rip6 條帶，C 代表效應(yīng)子 Rip13 條帶。用效應(yīng)子 Rip5, Rip6 和 Rip13 特異引物 PCR 擴(kuò)增檢測轉(zhuǎn)基因植株Fig. 6 PCR analysis of the effectors transgenicplantsLane M: Trans 2k DNAmaker; E3 negative control; Number stand for effectors different transgeniclines. Ais forRip5 band, B is for Rip6 band, C is for Rip13 band. PCR analysis of OE-effector lines by effector primer pair.3.1.4.2 轉(zhuǎn)錄水平檢測由于效應(yīng)子是外源基因，所以采用半定量 PCR 進(jìn)行表達(dá)量檢測，陽性轉(zhuǎn)基因株系提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后，進(jìn)行表達(dá)量檢測，以 Actin 為內(nèi)參基因，先用 PCR 反應(yīng)在低循環(huán)數(shù)下將各樣品的 cDNA 濃度調(diào)成基本一致。然后使用

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本文編號：2813378