【摘要】：桿狀病毒是一類具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒,其基因組大小為80-180 kb,在自然界中以節(jié)肢動(dòng)物作為專一性宿主進(jìn)行感染和傳播。桿狀病毒區(qū)別于其他病毒的一個(gè)顯著特征是病毒生活史中產(chǎn)生兩種不同的病毒粒子形態(tài):一種為包埋型病毒粒子(Occlusion-derived virus,ODV),在病毒經(jīng)口感染過程中,ODV在宿主中腸強(qiáng)堿性環(huán)境下從包涵體內(nèi)釋放,感染中腸上皮細(xì)胞實(shí)現(xiàn)原發(fā)感染;另一種為出芽型病毒粒子(budded virus,BV),主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的感染。兩種類型病毒粒子都由多種結(jié)構(gòu)蛋白組成,其中BV囊膜的結(jié)構(gòu)較ODV簡單,病毒結(jié)構(gòu)蛋白通過相互之間的作用共同形成完整的病毒粒子,并且這些相互作用還具有除結(jié)構(gòu)支撐以外的其他功能。本研究以家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)為研究對象,利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)對其BV病毒結(jié)構(gòu)蛋白間的相互作用進(jìn)行了分析和驗(yàn)證。為進(jìn)一步探討病毒囊膜與核衣殼等結(jié)構(gòu)在病毒入侵細(xì)胞過程中的作用,構(gòu)建了能夠同時(shí)標(biāo)記BV病毒囊膜和衣殼的重組雙熒光病毒。利用序列截短突變的方式對BV最重要的囊膜融合蛋白GP64與相關(guān)蛋白間的互作進(jìn)行了深入分析,闡明了其參與互作的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。主要結(jié)論如下:1、探明了 BV病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)通過對27個(gè)主要BV結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行酵母雙雜交一對一篩選,發(fā)現(xiàn)了 57對蛋白相互作用,其中6對為自相互作用。進(jìn)一步用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證了其中的10對相互作用。根據(jù)迄今為止關(guān)于桿狀病毒蛋白互作的研究,發(fā)現(xiàn)VP39、FP和38K是桿狀病毒蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中參與蛋白互作最多的三個(gè)關(guān)鍵蛋白,由此推測它們可能是病毒結(jié)構(gòu)的主要骨架;還發(fā)現(xiàn)每種囊膜蛋白都與至少一個(gè)衣殼蛋白發(fā)生互作。根據(jù)這些蛋白互作信息,最終確立了 5組BV結(jié)構(gòu)蛋白間的互作網(wǎng)絡(luò)。這些結(jié)果對于深入理解桿狀病毒的結(jié)構(gòu)具有重要參考意義。2、成功構(gòu)建了同時(shí)標(biāo)記病毒囊膜和衣殼的雙熒光重組病毒為進(jìn)一步探究BV結(jié)構(gòu)蛋白中病毒囊膜和衣殼蛋白間的互作以期揭示病毒囊膜及衣殼這兩個(gè)結(jié)構(gòu)在病毒感染細(xì)胞過程中的作用,構(gòu)建了能夠同時(shí)標(biāo)記病毒囊膜及衣殼的雙熒光病毒。利用“A-red同源重組系統(tǒng)”將BmNPV病毒本身的vp39和gp64基因雙敲除,并在此基礎(chǔ)上利用該重組系統(tǒng)將融合有3個(gè)紅色熒光mCherry基因的vp39恢復(fù)到病毒基因組,再利用“Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)”將融合有綠色熒光egfp的gp64轉(zhuǎn)座到多角體啟動(dòng)子下游以恢復(fù)gp64。結(jié)果表明GP64融合EGFP和VP39融合3個(gè)mCherry一起成功整合到病毒基因組。其中,gp64C端融合egfp對病毒的產(chǎn)生沒有影響,但N端融合egfp后病毒產(chǎn)量顯著降低,表明gp64N端結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄涔δ芫哂兄匾饔�。該雙熒光重組病毒可以用于單個(gè)病毒粒子的實(shí)時(shí)追蹤和病毒結(jié)構(gòu)的研究,也可以利用EGFP和mCherry標(biāo)簽抗體對熒光信號(hào)進(jìn)行放大或是直接用于蛋白熒光共定位或亞細(xì)胞定位研究,為深入研究桿狀病毒的動(dòng)態(tài)感染過程和感染機(jī)制提供了一個(gè)有力工具。3、闡明了病毒主要囊膜融合蛋白GP64與主要衣殼蛋白VP39之間的互作特點(diǎn)GP64為BV病毒主要的特征性囊膜蛋白,VP39是主要的衣殼蛋白,它們兩者均為病毒中含量最高的重要結(jié)構(gòu)蛋白。因此,對GP64與VP39間的互作進(jìn)行深入分析對理解病毒囊膜與衣殼間的關(guān)系具有重要意義。根據(jù)GP64功能域的劃分構(gòu)建一系列GP64截短突變體,通過酵母雙雜交和Co-IP驗(yàn)證,鑒定了 GP64蛋白中1-78aa為與VP39互作的關(guān)鍵功能域。此外,通過免疫熒光觀察GP64全長和截短突變體與VP39在細(xì)胞中的亞定位及共定位,發(fā)現(xiàn)全長GP64與VP39在感染后24 h和48 h共定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,感染后72 h,GP64在細(xì)胞核膜形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),VP39逐漸進(jìn)入細(xì)胞核,這暗示GP64可能參與VP39轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核;感染后48 h,GP64(1-523 aa)與VP39在細(xì)胞核膜上存在環(huán)狀共定位,但隨著GP64 N端保留不斷減少,兩者的共定位由細(xì)胞核膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜,這表明VP39與GP64之間的互作對它們在細(xì)胞內(nèi)定位具有重要影響。4、闡明了主要囊膜融合蛋白GP64與FP、PKIP、38K之間的互作特點(diǎn)鑒于VP39、FP和38K(均為衣殼蛋白)是病毒蛋白互作中的核心蛋白,而PKIP是與結(jié)構(gòu)蛋白互作最多的結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白,為深入探究這些蛋白間的互作關(guān)系,進(jìn)一步對GP64與FP、PKIP、38K之間的互作特點(diǎn)進(jìn)行了解析。將GP64各序列截短突變體分別與FP,PKIP和38K進(jìn)行一對一酵母雙雜交分析,發(fā)現(xiàn)GP64與這三個(gè)蛋白的關(guān)鍵互作結(jié)構(gòu)域均位于其N端1-78 aa。熒光共定位分析發(fā)現(xiàn),GP64僅保留N端1-78aa仍與PKIP和FP均存在共定位,這與酵母雙雜交結(jié)果一致。GP64部分截短突變體與PKIP在感染后24 h的共定位發(fā)生在細(xì)胞核膜,這與GP64和VP39的共定位相似,暗示GP64可能參與將PKIP轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S884.51
【圖文】：

的融合蛋白；后者則因缺少ｇｐ科基因而利用Ｆ蛋白作為融合蛋白（７）。ｙ桿狀病毒逡逑僅限于感染昆蟲的中腸，沒有ＢＶ融合蛋白。下面以部分桿狀病毒ＬＥＦ８的進(jìn)化關(guān)逡逑系為例展示桿狀病毒的分類（圖１．１）。逡逑除了根據(jù)包涵體的形態(tài)及進(jìn)化關(guān)系對桿狀病毒分類外，另一類分類方式是根逡逑據(jù)桿狀病毒囊膜中核衣殼的數(shù)量進(jìn)行分類，分為單粒包埋型核型多角體病毒逡逑（Ｓｉｎｇｌｅ邋ｃａｐｓｉｄ邋ｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ，邋ＳＮＰＶ邋）和多粒包埋核型多角體病毒逡逑（Ｍｕｌｔｉｃａｐｓｉｄ邋ｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ，邋ＭＮＰＶ）（圖邋１．２）。這個(gè)特征對某些特定病逡逑Ｉ逡逑

邐Ｃ；ｒ？ｕｐ邋雇逡逑＊邐ａｎ４？＃ｖ邐ｒ逡逑圖１．１部分桿狀病毒的ＬＥＦ８的進(jìn)化關(guān)系。（８＞逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ邋ｏｆ邋ＬＥＦ８邋ｆｒｏｍ邋ｓｅｌｅｃｔｅｄ邋ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ．邋（８）逡逑２逡逑

．＇灔魏ｔｅ＊逡逑圖１．２感染黃杉毒蛾（Ｏｒ＾ｇｙ／ｆｌ／ｗｅＨｔ／她叩ｆｌｔｏ）的兩種核型多角體病毒，分別是單逡逑個(gè)囊膜中包埋單粒（上圖）和多粒（下圖）核衣殼。（８）逡逑上圖：ＯｐＳＮＰＶ。下圖：ＯｐＭＮＰＶ。逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｔｗｏ邋ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓｅｓ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ邋ｆｏｒ邋Ｏｒｇｙｉａ邋ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｓｉｎｇｌｅ邋（ｔｏｐ逡逑ｐａｎｅ�。╁澹幔睿溴澹恚酰欤簦椋穑欤邋澹ǎ猓铮簦簦铮礤澹穑幔睿澹欤╁澹睿酰悖欤澹铮悖幔穑螅椋洌螅澹睿觯澹欤铮穑澹澹ǎ福╁义希保矖U狀病毒的生活周期逡逑桿狀病毒在感染周期中會(huì)產(chǎn)生兩種遺傳物質(zhì)完全一樣但囊膜不同的病毒粒逡逑子，即包涵體衍生型病毒（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｖｉｒｕｓ，邋ＯＤＶ）和出芽型病毒（ｂｕｄｄｅｄ逡逑ｖｉｍｓ，邋ＢＶ）。前者負(fù)責(zé)昆蟲與昆蟲間的垂直傳播，而后者則負(fù)責(zé)細(xì)胞與細(xì)胞間的逡逑水平傳播（９）。桿狀病毒己經(jīng)進(jìn)化到在昆蟲的中腸中引發(fā)原發(fā)感染。昆蟲的中腸逡逑ＰＨ呈強(qiáng)堿性，高達(dá)１０．０到１２．０邋（１０），包涵體ＣＯＢ）在環(huán)境中穩(wěn)定但易溶于堿。逡逑當(dāng)０Ｂ被昆蟲攝食到達(dá)中腸后即被溶解并釋放出包涵體衍生型病毒（ＯＤＶ），ＯＤＶ逡逑通過囊膜蛋白與細(xì)胞膜融合感染中腸上皮細(xì)胞（１１），然后釋放出核衣殼，核衣逡逑殼通過肌動(dòng)蛋白聚合作用被運(yùn)送到細(xì)胞核表面，然后通過核孔復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核逡逑（１２，邋１３）。當(dāng)病毒ＤＮＡ被釋放到細(xì)胞核后，病毒基因的轉(zhuǎn)珙、ＤＮＡ復(fù)制和核衣殼逡逑組裝隨即發(fā)生。在感染的早期階段

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳章林;江紫生;易向民;劉佩芹;倪大石;;我國分離的流行性出血熱Chen株病毒結(jié)構(gòu)蛋白的組成[J];江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1987年02期

2 韓世杰,李瑞梅;腮腺炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1—4肽圖分析[J];山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1988年01期

3 程順峰;戰(zhàn)文斌;繩秀珍;;淋巴囊腫病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其抗原性分析[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2006年03期

4 朱海虹;馬傳貧病毒結(jié)構(gòu)蛋白分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2002年11期

5 謝偉;程洋;張勇;文水英;張德勇;馬永梅;;豬傳染性胃腸炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白及疫苗的研究進(jìn)展[J];四川畜牧獸醫(yī);2015年10期

6 劉閏夏;藺濤;韋祖樟;孫利廠;陸嘉琦;袁世山;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年12期

7 盛鵬,晏良遂,洪濤;關(guān)于流行性出血熱病毒和超微病理的研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1991年01期

8 龔振華,田相軍,劉俊輝,王玉東,蔣正軍;豬水泡病病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因的核苷酸序列分析[J];中國動(dòng)物檢疫;2005年02期

9 謝金文;沈志強(qiáng);任艷玲;魏鳳;;尼帕病毒結(jié)構(gòu)蛋白研究進(jìn)展[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2008年11期

10 王凡;劉建斌;祝秀梅;;小反芻獸疫病毒研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2009年14期

相關(guān)會(huì)議論文 前8條

1 袁世山;韋祖樟;譚菲菲;田德斌;李燕華;叢雁方;余丹丹;孫利廠;莊金山;孫志;;豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白的反向遺傳研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

2 丁夢蝶;王紅寧;曹海鵬;張志坤;;禽傳染性支氣管病毒結(jié)構(gòu)蛋白線性B細(xì)胞表位串聯(lián)表達(dá)及其抗原性鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第八屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2013年

3 謝金文;沈志強(qiáng);任艷玲;魏鳳;;尼帕病毒結(jié)構(gòu)蛋白研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)成立大會(huì)暨第一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

4 陳瑞玲;鄧穎琦;鐘穎;叢彥龍;;重組乳酸桿菌在黏膜免疫中的研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

5 楊靜;劉成;金梅林;;阻抑素基因影響流感病毒復(fù)制[A];細(xì)胞—生命的基礎(chǔ)——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)2013年全國學(xué)術(shù)大會(huì)·武漢論文摘要集[C];2013年

6 劉兆球;姜世金;常維山;;真核表達(dá)NDV F基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在CEF細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)成立20周年慶典暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下）[C];2003年

7 曹永長;史泉城;馬靜云;畢英佐;;傳染性囊病病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2在T4噬菌體表面的展示[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2002年

8 張健家;沈運(yùn)旺;許偉凡;王海萍;吳小鋒;;家蠶核型多角體病毒BV結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白相互作用的鑒定[A];浙江省科協(xié)服務(wù)科技創(chuàng)新項(xiàng)目——推進(jìn)蠶桑產(chǎn)業(yè)傳承發(fā)展論壇論文集[C];2017年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 張健家;家蠶核型多角體病毒BV病毒結(jié)構(gòu)蛋白間的互作網(wǎng)絡(luò)及GP64與相關(guān)蛋白互作分析[D];浙江大學(xué);2018年

2 葛恒濤;利用山羊乳腺生物反應(yīng)器制備具有免疫原性病毒結(jié)構(gòu)蛋白的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 陳曉珞;豬嵴病毒結(jié)構(gòu)蛋白的克隆及生物信息學(xué)分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2014年

2 李菲;用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

3 羅飛;豬偽狂犬病毒結(jié)構(gòu)蛋白gB和gD主要抗原區(qū)的原核表達(dá)以及豬血清PRVgB抗體間接ELISA檢測方法的建立[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

4 董春艷;miR-9與MCPIP1互作對流感病毒復(fù)制的影響[D];吉林大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2776627