【摘要】：棉花是我國重要的經(jīng)濟作物,近年來,多種棉花病害嚴重制約我國的棉花生產(chǎn)。棉花枯萎病被認為是造成棉花產(chǎn)量和品質(zhì)下降最嚴重的因素之一。MAPK級聯(lián)信號通路是真核生物中高度保守的信號通路,在識別放大外部信號,并將信號傳遞到細胞內(nèi)部過程中發(fā)揮重要的作用。大量的研究證實,MAPK級聯(lián)信號通路的激活是植物免疫反應(yīng)最早發(fā)生的事件之一,調(diào)控了多種植物抗毒素的生物合成和防衛(wèi)相關(guān)基因的表達。因此,深入研究MAPK級聯(lián)信號通路調(diào)控植物免疫反應(yīng)的分子機制,對于指導農(nóng)作物抗病育種具有重要的理論意義。然而,關(guān)于植物MAPK級聯(lián)信號通路的研究多在擬南芥等模式植物中進行,針對其他植物,特別是棉花等農(nóng)作物中MAPK級聯(lián)信號通路的功能研究還比較少,MAPK級聯(lián)信號通路的調(diào)控機制更是鮮有報道。本研究以陸地棉(Gossypium hirsutum L.)為實驗材料,通過生物化學、分子生物學、生物信息學等多種手段,明確了GhMKK6介導的MAPK級聯(lián)信號通路在調(diào)控棉花枯萎病抗性方面的重要作用,并探討了miRNA和MAPK支架蛋白對GhMKK6介導的MAPK級聯(lián)信號通路的調(diào)控機制。主要研究結(jié)果如下:(1)GhMKK6介導的MAPK級聯(lián)信號通路在調(diào)控棉花對枯萎病菌的抗性方面發(fā)揮重要作用,但過量激活GhMKK6會對植物自身造成傷害。GhMKK6是棉花A組MEKs基因,亞細胞定位分析表明該基因定位于細胞核中。表達模式分析發(fā)現(xiàn),枯萎病菌、SA和MeJA均能影響GhMKK6的表達水平,說明GhMKK6參與調(diào)控了棉花的免疫反應(yīng)。利用病毒介導的基因沉默技術(shù)在棉花中沉默GhMKK6后發(fā)現(xiàn),棉花對枯萎病菌的抗性顯著下降,SA介導的植物抗病信號通路相關(guān)基因的表達水平顯著低于對照棉花。利用農(nóng)桿菌介導的葉盤轉(zhuǎn)化法得到了GhMKK6超表達的轉(zhuǎn)基因煙草。在GhMKK6超表達轉(zhuǎn)基因煙草接種枯萎病菌后,盡管SA/JA介導的植物抗病信號通路相關(guān)基因的表達水平顯著高于對照煙草,但轉(zhuǎn)基因煙草仍表現(xiàn)出對枯萎病菌敏感的表型。利用點突變的方法,得到了組成型激活的GhMKK6和無活性的GhMKK6。在煙草葉片中瞬時表達不同活性的GhMKK6后發(fā)現(xiàn),盡管煙草葉片都出現(xiàn)萎黃的癥狀,但瞬時表達組成型激活的GhMKK6可以通過促進下游抗性基因的表達,ROS的產(chǎn)生,SA/JA介導的植物抗病信號通路等提高植物對枯萎病菌的抗性。然而,GhMKK6的過量激活會導致活性氧的大量積累,產(chǎn)生類病斑,進而影響植物正常的生長發(fā)育。(2)ghr-miR5272a與GhMKK6組成了一個反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng),ghr-miR5272a通過反饋調(diào)節(jié)的方式,調(diào)控GhMKK6的表達水平,防止GhMKK6過量激活。對棉花miRNA深度測序結(jié)果分析后發(fā)現(xiàn),ghr-miR5272a與GhMKK6的3′非編碼區(qū)同源性較高。進一步的實驗證明,GhMKK6是ghr-miR5272a的靶基因,ghr-miR5272a通過識別GhMKK6的3′非編碼區(qū),剪切GhMKK6的mRNA,調(diào)控GhMKK6的表達水平。表達模式分析發(fā)現(xiàn),SA不能誘導ghr-miR5272a的表達,而MeJA和枯萎病菌都能誘導ghr-miR5272a的表達,ghr-miR5272a的表達模式與GhMKK6的表達模式互補,說明ghr-miR5272a可能通過影響GhMKK6的表達水平參與調(diào)控棉花對枯萎病菌的防衛(wèi)反應(yīng)。在棉花中沉默ghr-miR5272a后發(fā)現(xiàn),GhMKK6對枯萎病菌的響應(yīng)受到了顯著抑制,SA/JA介導的植物抗病信號通路相關(guān)基因的表達水平顯著高于對照棉花,且表達模式與GhMKK6超表達轉(zhuǎn)基因煙草接種枯萎病菌后的表達模式相似。而在超表達miR5272的棉花中,GhMKK6的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著降低。超表達miR5272的棉花對枯萎病菌的抗性顯著低于對照棉花,SA/JA介導的植物抗病信號通路相關(guān)基因的表達模式與GhMKK6沉默棉花接種枯萎病菌后的表達模式相似。(3)利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出GhMKK6的互作蛋白。利用棉花總RNA構(gòu)建了棉花酵母雙雜交文庫,文庫庫容為1.4×10~6,插入片段平均長度約為1000bp。利用GhMKK6的開放閱讀框全長序列構(gòu)建了誘餌載體。自激活活性及毒性檢測實驗表明,該誘餌載體無自激活活性和毒性。利用誘餌載體通過酵母雙雜交技術(shù)進行GhMKK6互作蛋白的篩選。在去除重復基因、不能翻譯片段和測序失敗片段后,共得到10個有意義的基因片段。通過序列分析及基因功能預測發(fā)現(xiàn),篩選得到的10個GhMKK6互作蛋白主要與基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,信號通路的轉(zhuǎn)導,碳水化合物的代謝以及氧化還原過程有關(guān)。(4)GhMORG1是酵母雙雜交篩庫得到的GhMKK6互作蛋白之一。GhMORG1作為MAPK級聯(lián)信號通路的支架蛋白,通過調(diào)控GhMKK6介導的MAPK級聯(lián)信號通路影響棉花對枯萎病菌的抗性。GhMORG1的開放閱讀框全長序列為900bp,編碼一個由299個氨基酸殘基組成的多肽。序列分析及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測發(fā)現(xiàn),該基因含有7個串聯(lián)的WD40結(jié)構(gòu)域,并形成環(huán)狀的β-螺旋結(jié)構(gòu),可作為MAPK的支架蛋白調(diào)控MAPK級聯(lián)信號通路。亞細胞定位分析表明,該基因與GhMKK6一樣都定位于細胞核中。通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗發(fā)現(xiàn),GhMORG1與GhMKK6在細胞核中發(fā)生相互作用。表達模式分析表明,GhMORG1的表達受到枯萎病菌和MeJA的誘導,說明GhMORG1也參與調(diào)控了棉花的免疫反應(yīng)。利用病毒介導的基因沉默技術(shù)得到了GhMORG1沉默的棉花植株。接菌實驗表明,GhMORG1沉默的棉花對枯萎病菌的抗性顯著下降,SA/JA介導的植物抗病信號通路相關(guān)基因的表達水平顯著低于對照棉花。進一步的實驗發(fā)現(xiàn),超表達GhMORG1的轉(zhuǎn)基因煙草對枯萎病菌的抗性顯著升高,且SA/JA介導的植物抗病信號通路相關(guān)基因的表達模式與GhMKK6超表達轉(zhuǎn)基因煙草接種枯萎病菌后的表達模式相似。
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S435.62
【圖文】：

棉花 GhMKK6 介導的 MAPK 級聯(lián)信號通路生物學功能及調(diào)控機制研究遞到細胞內(nèi)部（de Zelicourt et al., 2016）（圖 1-1）。MAPKs 可以使多種轉(zhuǎn)錄因子及其他信號通路組分磷酸化，調(diào)控下游基因的表達（Rodriguez et al., 2010）（圖 1-1）。磷酸化是一種使蛋白質(zhì)功能多樣化的修飾方式。蛋白添加了大量帶負電荷的磷酸基，可以顯著改變蛋白的性質(zhì)，如蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和酶活性等（Lampard et al., 2008）。研究表明，被MAPK 級聯(lián)信號通路磷酸化的蛋白可以通過影響蛋白穩(wěn)定性、亞細胞定位、DNA 結(jié)合能力、蛋白間相互作用以及其他轉(zhuǎn)錄后修飾過程等調(diào)控一系列細胞反應(yīng)（Yang et al.,2003；Whitmarsh, 2007；Rodriguez and Crespo, 2011）。

山東農(nóng)業(yè)大學博士學位論文2002）。根據(jù) MEKs 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點和序列分析，可將 MEKs 基因分為 A、B、C、D四個家族（MAPK Group, 2002）（圖 1-2）。根據(jù)蛋白間進化上的親緣關(guān)系，A 組 MEKs基因又可分為 A1、A2 兩個亞組（Chardin et al., 2017）。而 B 組 MEKs 基因的結(jié)構(gòu)較為特殊，其 C 末端含有一個核轉(zhuǎn)運因子 2 結(jié)構(gòu)域（MAPK Group, 2002；Chardin et al., 2017）。MEKs 通過介導不同的 MAPK 級聯(lián)信號通路，調(diào)控多種細胞反應(yīng)的進行。

山東農(nóng)業(yè)大學博士學位論文圖 1-3）。Danquah 等研究發(fā)現(xiàn)，MEK3 介導的 MAPK 級聯(lián)信號通路（由 MEKK17/EK3，C 組 MAPK1/2/7/14 組成）可以被脫落酸（ABA）激活，調(diào)控植物對非生物的抗性（Danquah et al., 2015）。進一步的研究表明，棉花中的 MEK3 可以通過激活 MAPK 基因 MAPK7，促進下游質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因 PIP1（Plasma membrane intrinrotein 1）的表達，調(diào)控棉花對干旱脅迫的響應(yīng)（Wang et al., 2016）。另外，有報道指南芥 MEK3 還可以被藍光激活，而激活后的 MEK3 通過 MEK3-MAPK6 信號轉(zhuǎn)導磷酸化下游 MYC2 轉(zhuǎn)錄因子，進而影響擬南芥光形態(tài)建成（Sethi et al., 2014）。

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