【摘要】：在前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)殺線蟲芽孢桿菌B16能夠有效殺死松材線蟲,是較為理想的松材線蟲生防細(xì)菌,可作為松材線蟲防治的生防菌進(jìn)行開發(fā)使用。隨著研究的深入,我們發(fā)現(xiàn)一些松材線蟲腸道內(nèi)生菌可以抑制殺線蟲芽孢桿菌B16的生長繁殖,抑制殺線蟲芽孢桿菌B16在線蟲體內(nèi)的定植。其中SCO41菌株是線蟲腸道內(nèi)生菌中對殺線蟲芽孢桿菌B16定植作用抑制最為明顯的一株,實驗找出內(nèi)生菌SCO41菌株對殺線蟲芽孢桿菌B16定植抑制的機(jī)制,就可以通過生物學(xué)的方法和手段對殺線蟲芽孢桿菌B16進(jìn)行改良,或者通過改變線蟲腸道內(nèi)生菌的菌落平衡,來增強(qiáng)殺線蟲芽孢桿菌B16在線蟲體內(nèi)的定植效果,增強(qiáng)其對線蟲的殺滅能力,進(jìn)而為以殺線蟲芽孢桿菌B16為生防細(xì)菌開發(fā)新的生防菌劑提供參考依據(jù)。本研究利用多種生物學(xué)手段和方法,篩選、分離、純化得到線蟲腸道內(nèi)生菌,對線蟲腸道內(nèi)生菌SCO41菌株進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究,對其抑制殺線蟲芽孢桿菌B16定植的機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測,取得了預(yù)期效果。本研究主要得到以下研究結(jié)果。(1)從松材線蟲腸道內(nèi)篩選、分離、純化得到5株線蟲腸道內(nèi)生菌,對內(nèi)生菌菌株進(jìn)行了菌種保存;內(nèi)生菌命名為SCO1,SCO2,SCO6,SCO9和SCO41。(2)通過內(nèi)生菌活性測試實驗,得出了線蟲腸道內(nèi)生菌與殺線蟲芽孢桿菌B16的互作關(guān)系,其中內(nèi)生菌SCO1,SCO6對殺線蟲芽孢桿菌B16的定植生長沒有抑制作用;內(nèi)生菌SCO2,SCO9和SCO41能夠抑制殺線蟲芽孢桿菌B16在線蟲體內(nèi)的定植生長。其中,SCO41菌株對殺線蟲芽孢桿菌B16的定植生長抑制作用最為強(qiáng)烈。(3)詳細(xì)的研究了內(nèi)生菌SCO41菌株,經(jīng)分類鑒定,SCO41菌株呈桿狀,無鞭毛,為革蘭氏陰性細(xì)菌;菌落光滑呈圓形,透明,邊緣整齊,有粘性;經(jīng)實驗研究和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定發(fā)現(xiàn)SCO41菌株屬于植物病原菌屬Phytobacter中的一個新種。(4)對內(nèi)生菌SCO41菌株進(jìn)行全基因組序列測序分析,內(nèi)生菌SCO41菌株基因組測序共得到109,283個reads,基因組大小為1517Mbp,序列平均讀長為13,882bp,測序序列N50長度大小為18,679bp,測序序列平均質(zhì)量值為0.84。(5)對內(nèi)生菌SCO41菌株的全基因組序列測序結(jié)果進(jìn)行分析,基于全基因組測序分析結(jié)果,推測出了內(nèi)生菌SCO41菌株抑制殺線蟲芽孢桿菌B16定植的潛在機(jī)制。(1)內(nèi)生菌SCO41菌株的基因組中含有大量與鞭毛有關(guān)的編碼基因,但在對SCO41菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定時沒有發(fā)現(xiàn)菌株有鞭毛結(jié)構(gòu),推測這些基因編碼的蛋白與細(xì)菌的免疫有相關(guān),菌株鞭毛基因編碼產(chǎn)生的蛋白是抑制殺線蟲芽孢桿菌B16在線蟲腸道內(nèi)定植的主要物質(zhì)。(2)分析研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌SCO41菌株的基因組中含有15個與腸桿菌素Enterobactin相關(guān)的編碼基因,腸桿菌素Enterobactin是一種抗生素,能夠作用于其他細(xì)菌,因此推測SCO41菌株的腸桿菌素Enterobactin是抑制殺線蟲芽孢桿菌B16在線蟲腸道內(nèi)定植的主要因子。(3)在內(nèi)生菌SCO41菌株的基因組注釋結(jié)果中發(fā)現(xiàn)含有蛋白分泌系統(tǒng)T6SS中的HIS-I相關(guān)的編碼基因11個,在注釋得到的總注釋結(jié)果中占有較大的比例,HIS-I的攻擊對象是菌株生存環(huán)境中的其他細(xì)菌,通過對其他細(xì)菌的攻擊使自身在環(huán)境中形成競爭優(yōu)勢,由此推測通過T6SS中的HIS-I分泌系統(tǒng)攻擊生存環(huán)境中的其他競爭菌株是SCO41菌株抑制殺線蟲芽孢桿菌B16在線蟲腸道內(nèi)定植的潛在機(jī)制之一。綜上實驗研究結(jié)果表明,線蟲腸道內(nèi)生菌對線蟲的免疫功能有一定的作用,一些內(nèi)生菌能夠降低生防細(xì)菌對線蟲本身的殺滅作用。內(nèi)生菌SCO41菌株能夠抑制殺線蟲芽孢桿菌B16在松材線蟲腸道內(nèi)的定植,從基因水平探究SCO41菌株對殺線蟲芽孢桿菌B16抑制機(jī)制,能夠為以殺線蟲芽孢桿菌B16為生防菌開發(fā)新的松材線蟲生防菌劑提供理論支撐;也為通過其他生物學(xué)手段來改造生防細(xì)菌或改變松材線蟲腸道菌落結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)生防菌對線蟲的殺滅作用提供基礎(chǔ)依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點是從線蟲腸道內(nèi)生菌與線蟲生防細(xì)菌的關(guān)系入手來研究,用新的思路來考慮生防細(xì)菌的定植效果和生防細(xì)菌對線蟲的殺滅效果,為提升生防菌在線蟲腸道內(nèi)的定植效果和以殺線蟲芽孢桿菌B16為生防菌來開發(fā)新的生防菌劑提供支持。
【學(xué)位授予單位】：南陽師范學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S763.18
【圖文】：

圖 3-1 5 株內(nèi)生菌與 B16 互作結(jié)果Fig 3-1 Interaction between 5 endophytes and B16注： 1：SCO1； 2：SCO2 ；3：SCO6； 4：SCO9；5：SCO41； 對：LB 液體培養(yǎng)基Note：part 1:SCO1； part 2: SCO2；part 3: SCO6； part 4: SCO9；part 5: SCO41； part 6: LB；內(nèi)線蟲腸道內(nèi)生菌對生防菌定植障礙測試驗通過平板轉(zhuǎn)移喂養(yǎng)法進(jìn)行，實驗過程中不同時間段使用熒光顯微鏡對，發(fā)現(xiàn)不同時間段，完全喂養(yǎng) SCO41 菌株的線蟲體內(nèi)被標(biāo)記過的殺線16 的含量很少，沒有發(fā)現(xiàn) full 類型的線蟲；混合喂養(yǎng)了內(nèi)生菌菌株 S1 菌株的線蟲體內(nèi)隨著時間的不斷增長，體內(nèi)的殺線蟲芽孢桿菌 B16 的，發(fā)現(xiàn)了 full 類型的線蟲，數(shù)量少于喂養(yǎng)了內(nèi)生菌 SCO1 菌株實驗組和

南陽師范學(xué)院碩士學(xué)位論文.3 內(nèi)生菌 SCO41 的分類鑒定.3.1 形態(tài)鑒定經(jīng)過實驗研究觀察，發(fā)現(xiàn)線蟲腸道內(nèi)生菌 SCO41 菌株的菌落濕潤，菌落小而，呈圓形，邊緣較為圓滑，光澤度較高，質(zhì)地較軟，顏色透明，在挑取時有粘性經(jīng)過革蘭氏染色實驗觀察，發(fā)現(xiàn) SCO41 菌株呈紅色，屬于革蘭氏陰性菌。經(jīng)掃描電鏡實驗觀察，SCO41 菌株呈桿狀或短桿狀，長度約 1.525～2.557μm度約 0.5547μm，無鞭毛結(jié)構(gòu)。

圖 3-4 SCO41 菌株的生長曲線圖Fig 3-4 Growth curve of SCO41API 20E 實驗條測試結(jié)果根據(jù) API 20E 生化反應(yīng)表判定反應(yīng)結(jié)果，得到 ONPG，CIT，GLU，MAN，SORRHA，SAC，AMY，ARA 等 9 個反應(yīng)結(jié)果呈陽性，說明 SCO41 菌株能夠利用這些底物；其他反應(yīng)呈陰性，說明 SCO41 菌株不能利用這些物質(zhì)。具體結(jié)果如表 3-23。表 3-2 API 20E 測試結(jié)果Tab3-2 Results of API 20E反應(yīng)底物及反應(yīng)酶 檢測結(jié)果GEL Kohn 明膠 明膠酶 -ADH 精氨酸 精氨酸雙水解酶 -URE 尿素 尿酶 -

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