【摘要】：棉花黃萎病(Verticillium wilt)是一種通過(guò)土壤和種子傳播的維管束真菌病害,致病菌(Pathogenic bacteria)多數(shù)為大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)。黃萎病嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì),給棉花產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大威脅,培育優(yōu)質(zhì)高抗黃萎病的棉花品種是控制黃萎病蔓延的有效方式之一。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的人工定向選擇,栽培棉種的農(nóng)藝性狀與經(jīng)濟(jì)性狀不斷優(yōu)化,但遺傳基礎(chǔ)狹窄、缺乏新的優(yōu)良基因成為限制抗病育種取得進(jìn)展的重要原因。野生棉生長(zhǎng)環(huán)境惡劣、多有病蟲(chóng)害發(fā)生并與栽培棉種形成生殖隔離。前期研究證實(shí)多種野生棉具有優(yōu)異的抗病性狀,因此挖掘野生棉中抵御黃萎病的潛在基因資源具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。本研究對(duì)D基因組棉種雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D_5)、三裂棉(G.trilobum,D_8)和瑟伯氏棉(G.thurberi,D_1)進(jìn)行了室內(nèi)苗期黃萎病的抗性鑒定,隨后獲得0h(對(duì)照)、12h和48h大麗輪枝菌侵染3個(gè)棉種的根、莖、葉材料,共構(gòu)建81個(gè)文庫(kù)并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,為挖掘D基因組野生棉中的抗病基因奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.雷蒙德氏棉、三裂棉和瑟伯氏棉的室內(nèi)苗期黃萎病抗性鑒定:3個(gè)棉種抗性差異明顯,接菌25天后,瑟伯氏棉達(dá)到抗病水平,雷蒙德氏棉與三裂棉感病。解剖病菌處理25天后的棉株莖段,雷蒙德氏棉維管束嚴(yán)重褐化。觀察3個(gè)棉種使用帶綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的大麗輪枝菌侵染3h、6h和12h的根尖壓片,發(fā)現(xiàn)瑟伯氏棉根尖的菌絲生物量和生長(zhǎng)受到極大限制。綜上,3個(gè)棉種的黃萎病抗性由強(qiáng)到弱分別是瑟伯氏棉、三裂棉和雷蒙德氏棉。2.野生棉材料響應(yīng)大麗輪枝菌早期侵染的轉(zhuǎn)錄組分析:通過(guò)Illumina Hiseq~(TM)4000平臺(tái)對(duì)病菌處理0h(對(duì)照)、12h和48h的3個(gè)棉種的根、莖、葉材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。以雷蒙德氏棉基因組序列為參考進(jìn)行比對(duì),獲得37223個(gè)基因。差異表達(dá)基因(DEGs)的聚類分析顯示,瑟伯氏棉葉中的DEGs數(shù)量最多,三裂棉和瑟伯氏棉根和莖中的DEGs比雷蒙德氏棉多,表明抗病棉種能誘導(dǎo)更多基因表達(dá)。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs顯著富集在氧化還原過(guò)程(oxidation-reduction process),說(shuō)明病菌侵染激活了棉株的抗氧化系統(tǒng)。KEGG功能富集分析DEGs顯著富集在碳水化合物代謝通路(carbohydrate metabolism),表明植物免疫應(yīng)激反應(yīng)需要大量能量。3.D基因組ABC(ATP-binding cassette)基因家族的鑒定與分析:轉(zhuǎn)錄組KEGG分析中膜轉(zhuǎn)運(yùn)通路(membrane transport)66%的DEGs為ABC基因家族成員,推測(cè)ABC基因參與野生棉的黃萎病抗性調(diào)控。從雷蒙德氏棉基因組中鑒定到166個(gè)ABC基因,其中165個(gè)隨機(jī)分布在13條染色體上,1個(gè)定位于Scaffold。轉(zhuǎn)錄組中檢測(cè)到96.4%ABC基因。ABC基因擁有多樣的理化性質(zhì),親水性平均系數(shù)(GRAVY)均小于1。通過(guò)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),141個(gè)ABC基因編碼的蛋白質(zhì)定位于質(zhì)膜。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)水平與系統(tǒng)發(fā)育分析,從160個(gè)基因中篩選出44個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)水平與3個(gè)棉種的抗性一致。進(jìn)一步結(jié)合轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平及qRT-PCR篩選出抗病候選基因Gorai.007G244600,將相似性達(dá)99.71%的陸地棉同源基因Gh_D11G3432沉默。大麗輪枝菌處理后表型及生理生化指標(biāo)測(cè)定發(fā)現(xiàn)該抗病候選基因在棉花抵御黃萎病中有一定作用。4.D基因組Bet v 1基因家族的鑒定與分析:通過(guò)功能域PF00407,在雷蒙德氏棉中鑒定出59個(gè)Bet v 1基因,除4個(gè)基因定位于scaffold外,其余55個(gè)Bet v 1基因分布在二倍體(D_5)棉花基因組13條染色體中的8條。理化性質(zhì)分析顯示Bet v 1氨基酸序列長(zhǎng)度變化范圍較小,多數(shù)Bet v 1蛋白為親水性蛋白。系統(tǒng)發(fā)育分析表明Bet v 1蛋白質(zhì)高度保守。RNA-seq結(jié)合qRT-PCR發(fā)現(xiàn)三個(gè)棉種的Bet v 1基因的表達(dá)模式與三個(gè)棉種的抗感性相符。從D基因組Bet v 1中篩選出一個(gè)抗病候選基因Gorai.012G129000(BETV1-54),運(yùn)用VIGS技術(shù)沉默陸地棉中相似性達(dá)99.58%的同源基因Gh_D04G1399,表型及病情指數(shù)顯示該基因在棉花抗黃萎病中發(fā)揮功能。
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S435.621.2
【圖文】：

圖 1.1 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在于所有生物體中，尤其是植物中（Jae-UngHwang et al.,201gure 1.1 ABC transporters are present in all organisms, especially in plants (Jae-Ung Hwang et aBC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)BC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)體系獨(dú)特，包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域。在分子生物學(xué)中，其功能相適應(yīng)。典型的 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)由兩個(gè)區(qū)域組成：嵌入雙層膜中的MD）和嵌于細(xì)胞膜而向細(xì)胞質(zhì)突出的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）[3每個(gè) TMD 由 6 個(gè) α 螺旋構(gòu)成，為底物分子運(yùn)輸提供通道；核苷酸結(jié)提供能量（圖 1.2）。每個(gè) NBD 內(nèi)有 200 個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的保守結(jié) A 模體和 Walker B 模體。這兩個(gè)模體被 120 個(gè)氨基酸隔開(kāi)。Walke B 模體中間含有 ABC 特征模體（LSSGQ）、D 環(huán)、H 環(huán)和 Q 環(huán)[36]。大約 200 個(gè)氨基酸殘基）能結(jié)合和水解 ATP，從而在大量生物過(guò)程中TP 水解[29]。除這四個(gè)結(jié)構(gòu)域之外，還能發(fā)現(xiàn)一些元素與可能起調(diào)節(jié)作合在一起[35]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域數(shù)量和排序方向?qū)?ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被分成 運(yùn)子，一條獨(dú)立肽鏈含有兩個(gè)“NBD-TMD”，排序?yàn)?TMD-NBD-T

圖 1.2ABC 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)催化機(jī)制的模型（MichalJasinski，2003）ure 1.2 Model of ABC protein transport catalytic mechanism (Michal Jasin家族的分類 命名系統(tǒng)中，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育途徑和結(jié)構(gòu)特征將 ABC ）。ABCB、ABCC 和 ABCG 亞族的分析最為廣泛[37白，涵蓋 ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、AOH）、ABCB（MDR）、ABCC（MRP）、ABCD（轉(zhuǎn)運(yùn)子，在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要作用。ABCE/F 亞家功能，部分基因與調(diào)控蛋白合成有關(guān)[31]。其它全部為CA 亞族在植物中的研究較少，在脊椎動(dòng)物中主要負(fù)B 亞家族成員廣泛存在于真核細(xì)胞中，與線粒體多肽/鐵簇蛋白的產(chǎn)生、抗原合成和多效耐藥性等過(guò)程相關(guān)和次生代謝物的運(yùn)輸[38, 42]。ABCC 亞家族部分成員與物和糖基化軛合物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)[36]。已發(fā)現(xiàn)的 ABCC 亞

3.1 大麗輪枝菌侵染雷蒙德氏棉、瑟伯氏棉和三裂棉的表型分析本研究首先對(duì)雷蒙德氏棉，三裂棉和瑟伯氏棉 3 個(gè) D 基因組野生棉進(jìn)行了室內(nèi)黃萎病抗性鑒定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上獲得相似結(jié)果。在強(qiáng)致病性大麗輪枝菌系處理 25 天后，3 個(gè)棉種出現(xiàn)了明顯的表型差異（圖 3.1）。雷蒙德氏棉超過(guò) 50%的棉株生長(zhǎng)點(diǎn)死亡，三裂棉枯死 10%，瑟伯氏棉只有 1~2 株枯死。雷蒙德氏棉大部分真葉黃化掉落，葉脈顏色明顯加深，有些能看到清晰的紅褐色脈絡(luò)，子葉干癟皺縮，莖段從土面以上能看到不同程度的褐化。三裂棉的發(fā)病癥狀比雷蒙德氏棉輕，莖稈上保留部分真葉。瑟伯氏棉的發(fā)病程度最輕，真葉的黃化和掉落最少，部分棉株沒(méi)有明顯發(fā)病癥狀。通過(guò)比較 3 個(gè)棉種大麗輪枝菌處理后 25 天的病情指數(shù)發(fā)現(xiàn)瑟伯氏棉能達(dá)到抗病水平；三裂棉病情指數(shù)偏高，但死亡率低；雷蒙德氏棉達(dá)到高感病水平（圖 3.2）�？剐詫�(duì)照亞洲棉和感病對(duì)照戴維遜氏棉的病情指數(shù)分別為 17.50 和 50.00，抗感之間差異明顯，說(shuō)明該方法具有較好的篩選性。

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