【摘要】：本研究通過透射電鏡法觀察和RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)對遼寧省沈陽地區(qū)和蓋州地區(qū)蘿卜葉片樣品中的病毒進(jìn)行了檢測與鑒定,確定侵染遼寧省沈陽地區(qū)和蓋州地區(qū)蘿卜的病毒為馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)的馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)中的蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)。本文測定了三個TuMV遼寧分離物的全基因組和十六個TuMV遼寧分離物的外殼蛋白(coat protein,cp)序列,豐富了遼寧省沈陽地區(qū)和蓋州地區(qū)蘿卜病毒資源,為蘿卜病毒病的防治工作奠定理論基礎(chǔ)。(1)2017年5月,在遼寧省沈陽市采集到6個呈現(xiàn)泡狀褪綠的蘿卜樣品,使用透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察到700×13nm的線性病毒粒子。初步判定該病毒粒子為典Potyvius線性粒子。利用Potyvirus通用引物PVY-legpoty-F/R對所采集的樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增后得到1200 bp片段,克隆測序后進(jìn)行Blast比對,結(jié)果表明該樣品同蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的同源性最高。利用已經(jīng)報道的擴(kuò)增TuMV特異引物TuMV-CP-F/R在6個樣品中均擴(kuò)增到約1000bp的片段,包含完整的外殼蛋白(coat protein,cp)。同源性比對發(fā)現(xiàn),6個樣品的cp基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均高于90%,說明他們是用一個病毒的不同分離物。選取LN-sy分離物,基于美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)上TuMV全基因組序列設(shè)計擴(kuò)增6對引物,TuMV-1F/1R,TuMV-2F/2R,TuMV-3F/3R,TuMV-4F/4R,TuMV-5F/5R,TuMV-6F/6R擴(kuò)增得到該樣品上病毒的全基因組。該病毒的基因組由9855個核苷酸組成�；赾p基因進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)沈陽地區(qū)蘿卜樣品與TuMV的中國分離物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)同源性最高,同源性為99.8%。基于cp基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)TuMV LN-sy與TuMV的中國分離物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)在同一分支上。根據(jù)國際病毒分類委員會(International Committeeon Taxonomy of Viruses,ICTV)第九次報告和2018版分類系統(tǒng)中報道的Potyviridae分類標(biāo)準(zhǔn),斷定LY-sy是TuMV的遼寧沈陽分離物。(2)2017年5月,在遼寧省蓋州市采集10個呈現(xiàn)矮化或葉片斑駁的蘿卜樣品,使用透射電鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)在兩種癥狀病葉中均觀察到約800×13nm的線性病毒粒子。初步判定病樣受到Potyvius病毒侵染。利用(1)中TuMV-CP-F/R引物在10個樣品中均擴(kuò)到約1000bp的cp基因。選取矮化癥狀的TuMV-GZ1分離物和葉斑駁癥狀的TuMV-GZ5進(jìn)行全基因組測序,發(fā)現(xiàn)TuMV-GZ1和TuMV-GZ5基因組分別為9867nt和9856nt組成�；赾p基因進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)TuMV-GZ1和TuMV-GZ5均與TuMV的中國分離物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)同源性最高,同源性為99.4%�；赾p基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,兩個分離物與TuMV的中國分離物TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153038)和TuMV-[China:Raphanus sativus](KR153040)聚在同一分支上。根據(jù)國際病毒分類委員會(International Committeeon Taxonomy of Viruses,ICTV)第九次報告和2018版分類系統(tǒng)中報道的Potyviridae分類標(biāo)準(zhǔn),斷定TuMV-GZ1和TuMV-GZ5是TuMV的遼寧蓋州分離物。這是遼寧省首次報道蘿卜感染TuMV。
【學(xué)位授予單位】：沈陽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.31
【圖文】：

11圖 2.1 遼寧省沈陽地區(qū)采集的蘿卜病葉圖片e of disease leaves of Raphanus sativus L.collected in Shenyang Province粒載體EN（天根生化科技（北京）有限公司）購買大腸桿菌生物工程（大連）有限公司）購買 pMD-18T、pMD

第 2 章 沈陽地區(qū)蘿卜病毒病的鑒定與序列分析結(jié)果分析卜病葉樣品電鏡觀察結(jié)果鮮蘿卜病葉于透射電鏡下，進(jìn)行病毒粒子觀察，可見約 700×病毒粒子表面無包膜（圖 2.2）。該病毒粒子從形態(tài)特征上顯示 Potyvirus 屬成員。osaic virus-[China: Brassica napus L. ] TuMV-[CN: Brassica napus L.] KF463308osaic virus-[China: Raphanus sativus] TuMV-[CN: Raphanus sativus] KR153038osaic virus-[China:Raphanus sativus] TuMV-[CN:Raphanus sativus] KR153040

沈陽大學(xué)碩士學(xué)位論文 LN-sy1 樣品，利用六對引物（表 2.2）對蘿卜病葉的 cDNA 進(jìn)增，結(jié)果如圖 2.4 顯示，依次得到 1200bp（泳道 1）、1800bp（泳道 5）、1500bp（泳道 7）、1800bp（泳道 9）、1000bp（泳段，健康植物中無任何條帶（泳道 2、4、6、8、10 和 12）。所克隆測序，經(jīng)拼接得到全長基因組序列。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 洪健;周雪平;;ICTV第九次報告以來的植物病毒分類系統(tǒng)[J];植物病理學(xué)報;2014年06期

2 陳曉英;方榮祥;;中國植物病毒研究40年[J];微生物學(xué)通報;2014年03期

3 潘春清;張俊華;崔崇士;文景芝;;蕪菁花葉病毒研究現(xiàn)狀[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2008年01期

4 馮焱;何建;聶振朋;于莉娟;桑有順;;RT-PCR技術(shù)及其在馬鈴薯病毒檢測中的應(yīng)用[J];南方農(nóng)業(yè);2007年06期

5 杜琳;鐘先鋒;陳劍泓;易軍鵬;;植物病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J];農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊);2007年07期

6 楊國慧;張仲凱;崔崇士;;云南、黑龍江兩省南瓜主要病毒病原種類鑒定[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2007年01期

7 趙建平,周釵美,陳集雙,郭得平;蕪菁花葉病毒(TuMV)特性的研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)通報;2004年06期

8 陳炯,陳劍平;Potyvirus屬成員基因組全序列的簡并引物PCR和RACE擴(kuò)增方法[J];病毒學(xué)報;2002年04期

9 陳集雙;番紅花花葉病的發(fā)生與防治[J];浙江農(nóng)業(yè)科學(xué);2000年03期

10 鐘秀容,陳蓮云,陳文列;制備電鏡超薄切片的技巧[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1999年02期

本文編號：2766107