【摘要】：小麥條銹病是由小麥條銹菌(Puccinia stiiformis f.sp.tritici)引起的小麥重大病害,在世界范圍內(nèi)危害嚴(yán)重。利用抗病品種進(jìn)行防治仍然是目前最經(jīng)濟(jì)最有效的方式。然而,條銹菌毒性變異頻繁,新的毒性小種出現(xiàn)使得抗病基因不斷被克服,同時(shí)新的抗病品種的選育速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于毒性小種的更新速度。因此,研究小麥條銹菌的致病機(jī)理,尋找新的病害防控策略刻不容緩。小麥條銹菌作為活體寄生真菌,需要從活體細(xì)胞中吸收營(yíng)養(yǎng),并向寄主中分泌效應(yīng)蛋白調(diào)控寄主的免疫反應(yīng),促進(jìn)侵染。在銹菌與小麥的互作過(guò)程中的致病因子有很多,其中一類基因主要負(fù)責(zé)條銹菌的生長(zhǎng)及致病能力,相對(duì)保守;另外一類能夠分泌進(jìn)入寄主的體內(nèi),通過(guò)調(diào)節(jié)寄主的免疫系統(tǒng)以促進(jìn)病原菌侵染。效應(yīng)蛋白是侵染過(guò)程中分泌到寄主中促進(jìn)病原菌侵染的一類小分子蛋白,在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,產(chǎn)生了可以被寄主特異識(shí)別并引起過(guò)敏性壞死反應(yīng)的AVR蛋白和調(diào)節(jié)寄主免疫的其他效應(yīng)蛋白。然而條銹菌中重要效應(yīng)蛋白調(diào)控小麥的機(jī)理我們知之甚少。本研究選取銹菌富含甘氨酸絲氨酸的效應(yīng)蛋白PstGSRE1進(jìn)行研究,分析其序列特點(diǎn),解析其變異特征;利用瞬時(shí)表達(dá)、亞細(xì)胞定位、寄主誘導(dǎo)的基因沉默(Host-Induced Gene Silencing,HIGS)等方法,解析PstGSRE1的時(shí)空表達(dá)特征、毒性及無(wú)毒性功能;進(jìn)一步通過(guò)蛋白互作技術(shù)獲得其在小麥中的靶標(biāo)蛋白并明確其靶標(biāo)蛋白的功能。此外,本論文還利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(Host-Induced Gene Silencing,HIGS)靶向沉默小麥條銹菌致病因子PstCPK1基因,創(chuàng)制了持久抗條銹病的轉(zhuǎn)基因抗病材料。取得的主要結(jié)果如下:1.鑒定了1個(gè)小麥條銹菌富含甘氨酸和絲氨酸的效應(yīng)蛋白PstGSRE1。序列分析發(fā)現(xiàn)其N端含有具有分泌功能的信號(hào)肽,未發(fā)現(xiàn)保守結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)PstGERE1在侵染初期表達(dá)量顯著上調(diào)。毒性功能分析表明其可抑制Bax誘導(dǎo)的PCD;可抑制由EtHAn引起的胼胝質(zhì)累積及非親和菌株誘導(dǎo)的活性氧累積。亞細(xì)胞定位分析表明該效應(yīng)蛋白在寄主體內(nèi)活動(dòng)活躍,并且呈現(xiàn)一種活躍的流動(dòng)現(xiàn)象;2.瞬時(shí)沉默PstGSRE1,條銹菌的生長(zhǎng)明顯受到抑制,菌絲長(zhǎng)度,菌落面積及吸器數(shù)量減少,產(chǎn)孢的數(shù)量和面積大幅減少。表明該效應(yīng)蛋白對(duì)于銹菌毒性具有重要作用。通過(guò)構(gòu)建PstGSRE1的RNAi轉(zhuǎn)基因沉默載體,基因槍法獲得該基因的永久沉默轉(zhuǎn)基因植株,經(jīng)過(guò)多代的抗病選育,在T4代獲得3個(gè)抗病性提高的轉(zhuǎn)基因株系(L33、L34、L43),以上結(jié)果表明PstGSRE1是條銹菌重要的致病因子;3.為了解析該效應(yīng)蛋白在調(diào)控寄主免疫反應(yīng)的機(jī)理,我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到了PstGSRE1的候選靶標(biāo)蛋白,分別為TaLOL2、TaCAT1、TaCAT3、TaCIPK10等。利用酵母雙雜交系統(tǒng)確認(rèn)該效應(yīng)蛋白與TaLOL2的C端互作,并進(jìn)一步利用Pull-down技術(shù)和Co-IP技術(shù)確認(rèn)了PstGSRE1與TaLOL2的互作關(guān)系;4.序列分析發(fā)現(xiàn),效應(yīng)蛋白靶標(biāo)TaLOL2含有三個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)具有結(jié)合DNA的功能,在小麥中高度保守;存在3個(gè)拷貝,分別在5A、5B、5D上,且不同拷貝間相似性達(dá)96%以上。利用BSMV-VIGS技術(shù)瞬時(shí)沉默TaLOL2發(fā)現(xiàn)沉默植株對(duì)小麥條銹菌的抗病性顯著降低,活性氧和壞死面積顯著減少。利用T3SS系統(tǒng)在小麥中過(guò)表達(dá)該蛋白能夠顯著降低孢子堆的數(shù)量,表明其為小麥抗條銹病的正向調(diào)控因子;通過(guò)小麥原生質(zhì)體定位技術(shù)發(fā)現(xiàn)TaLOL2具有明顯的核定位信號(hào),并能在煙草中引起細(xì)胞死亡。5.PstGSRE1可以抑制TaLOL2誘導(dǎo)產(chǎn)生的壞死。熒光標(biāo)記兩個(gè)基因發(fā)現(xiàn):在煙草中,TaLOL2在核中具有明顯的累積,然而在效應(yīng)蛋白存在的情況下,TaLOL2主要在細(xì)胞質(zhì)中累積,導(dǎo)致其無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)寄主免疫反應(yīng)。表明條銹菌效應(yīng)蛋白PstGSRE1通過(guò)干擾TaLOL2進(jìn)核,從而抑制寄主免疫反應(yīng)而利于病菌的侵染。;6.鑒定了小麥條銹菌重要致病因子蛋白激酶A的催化亞基PstCPK1。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),PstCPK1在條銹菌侵染初期表達(dá)量逐漸升高,18h達(dá)到峰值,隨后逐漸降低。利用PstCPK1互補(bǔ)稻瘟菌CPK1突變體可以部分恢復(fù)其致病力。利用BSMV-HIGS瞬時(shí)沉默PstCPK1顯著降低了條銹菌的毒性,組織學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)病菌菌絲長(zhǎng)度和菌落面積均顯著下降。我們進(jìn)一步構(gòu)建PstCPK1永久沉默載體,通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化法對(duì)小麥品種西農(nóng)1376進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,所獲得的株系利用PCR鑒定并對(duì)陽(yáng)性植株進(jìn)行加代。經(jīng)過(guò)多代抗病選育,在T4代獲得2個(gè)抗病性提高的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系(L12和L18),并對(duì)插入小麥基因組的載體和所產(chǎn)生的小RNA分子進(jìn)行分子鑒定,進(jìn)一步明確了轉(zhuǎn)基因株系的組織細(xì)胞學(xué)和分子水平的變化,初步探究了轉(zhuǎn)基因株系的抗病分子機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S435.121.42
【圖文】：

曾士邁 2002)，冬孢子和性孢子一般無(wú)侵染能力(Voegele, R T and Mendgen, K幾種孢子均能寄生于不同的寄主。夏孢子、冬孢子以及擔(dān)孢子的寄主主要是如小麥、大麥、燕麥等，有些雜草也可以成為它們的侵染對(duì)象，而性孢子和要侵染轉(zhuǎn)主寄主小檗。銹菌的毒性變異主要源于在轉(zhuǎn)主寄主上的有性生殖,近面的研究漸漸成為熱點(diǎn)。具有雙核、每個(gè)核里有一組染色體稱為單倍型的夏利的環(huán)境條件下轉(zhuǎn)化成由兩個(gè)細(xì)胞組成的每個(gè)細(xì)胞都是單核二倍體的冬孢子過(guò)一次有絲分裂一次減數(shù)分裂分化出兩組先菌絲，先菌絲上著生兩種單核單子，具有（+）（-）兩種不同的配型，這兩種擔(dān)孢子侵染小檗，并在小檗葉種性子器，一種產(chǎn)生受精絲，一種產(chǎn)生單核單倍體的性孢子，性孢子和受精這樣的有性生殖過(guò)程在小檗葉片背面形成銹子器，銹子器產(chǎn)生很多銹子腔，釋放很多雙核單倍體的銹孢子，在小麥上侵染形成夏孢子，進(jìn)行下一輪的侵染然條件下，有性階段的周期通常是一年，在最適溫度條件下，無(wú)性繁殖的周，而低溫條件則需要幾個(gè)月。經(jīng)過(guò)這樣復(fù)雜的有性生殖過(guò)程，銹菌的毒性變?cè)黾樱瑮l銹菌的這種有性生殖過(guò)程不僅為銹菌增加變異頻率，也更加難以根主上的殘留銹菌，這也為銹菌的防治增加了非常大的難度。

圖 1-2 植物抗病性的分子基礎(chǔ)Figure 1-2 A model illustrates the molecular mechanism of the plant immune system (Wang et a2016).3.2 基因?qū)蚣僬f(shuō)ETI 免疫反應(yīng)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的演化，形成了植物抗病基因?qū)Σ≡男?yīng)蛋白類似一的識(shí)別關(guān)系。在亞麻銹菌的小種專化型抗性研究過(guò)程中，這種基因?qū)虻募僬f(shuō)or(1971)首次提出。這種基因?qū)虻募僬f(shuō)現(xiàn)如今已經(jīng)證明存在于幾十種不同的植原菌互作體系中，可以看作是一種較為普遍的植物體免疫病原菌的特異抗病性。這論提出：病原物侵染其寄主的時(shí)候會(huì)有兩種不同的表現(xiàn)型，親和體系和非親和體系原菌分別含有毒性基因（a）和無(wú)毒基因（A），所對(duì)應(yīng)的寄主則有感病基因（r）和基因（R）。無(wú)毒基因 V 可以被寄主的抗病基因 R 特異識(shí)別，迅速引發(fā)下游的過(guò)敏死反應(yīng)。其他幾種對(duì)應(yīng)關(guān)系不能引起寄主的壞死反應(yīng)，病原菌可以順利侵染寄主，主患病。在之后的研究中，也發(fā)現(xiàn)了不僅僅存在這種一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，也存在一個(gè)基因識(shí)別多個(gè)無(wú)毒基因或者多個(gè)抗病基因識(shí)別一個(gè)無(wú)毒基因的模式存在。對(duì)該理論

圖 1-3： RNA 沉默用于發(fā)展植物病害控制策略的一般機(jī)制和潛在應(yīng)用。Figure 1-3 General mechanism and potential application of RNA silencing for the development lant disease control strategies. (Cristiano et al. 2011).在 HIGS 中，RNA 轉(zhuǎn)移是從宿主到絲狀生物體。 然而，也存在向相反方向轉(zhuǎn)移能性。 真菌從復(fù)制的轉(zhuǎn)座子中產(chǎn)生沉默 RNA，經(jīng)由真菌 Dicer 處理，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中（最可能是雙鏈形式的 siRNA），在那里它們與植物 AGO1 結(jié)合并沉默植物基因表達(dá)。如果 HIGS 是單步機(jī)制，那么沉默 RNA 必須過(guò)量。 然而，植物和真菌持產(chǎn)生具有傳遞性和擴(kuò)增潛力的次級(jí) siRNA，如病毒 RNA 沉默。 因此，來(lái)自宿主的低豐度 siRNA 可能在真菌中引發(fā)大的沉默效應(yīng)，反之亦然：植物與絲狀真菌之間界沉默需要涉及大量的 RNA 的轉(zhuǎn)移。BSMV 沉默系統(tǒng)是單子葉植物中基因功能研主要工具，Yin et al. (2009)提出來(lái)用該系統(tǒng)研究小麥與條銹菌的基因功能。目前已量的小麥和銹菌的基因功能利用該系統(tǒng)進(jìn)行研究。.5.4.3 小麥的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)基因育種是我國(guó)分子育種的主要方向，加強(qiáng)農(nóng)藝性狀，提高抗性是轉(zhuǎn)基因育種

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李振岐;我國(guó)小麥品種抗條銹性喪失原因及其解決途徑[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);1980年03期

本文編號(hào)：2766088