【摘要】：飛蝗是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)害蟲,個(gè)體較大,易于解剖觀察,且具有敏感的RNA干擾系統(tǒng),是漸變態(tài)昆蟲的典型代表。由于長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥防治蝗災(zāi),不僅造成了環(huán)境的嚴(yán)重污染,同時(shí)導(dǎo)致了飛蝗對(duì)農(nóng)藥的抗藥性增加。因此研發(fā)新型的環(huán)保生物殺蟲劑是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。在昆蟲的生命周期里,蟲體由于外骨骼的覆蓋而不能自由伸展,導(dǎo)致昆蟲每生長(zhǎng)一個(gè)齡期,外骨骼就需要經(jīng)歷一次蛻皮再生過(guò)程,這個(gè)過(guò)程即為幾丁質(zhì)的代謝過(guò)程。幾丁質(zhì)是昆蟲外骨骼的重要組成成分,除此之外在其他部分組織中也占有很大的比例。幾丁質(zhì)脫乙�；冈趲锥≠|(zhì)降解過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用,可以催化幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為脫乙�；臍ぞ厶�。因此,基于幾丁質(zhì)降解途徑中起重要作用的功能基因研發(fā)生物殺蟲劑是現(xiàn)階段的可靠策略。本研究首先以飛蝗幾丁質(zhì)脫乙�；�(LmCDA1和LmCDA2)為研究對(duì)象,采用RNA干擾技術(shù),觀察干擾后飛蝗前后腸的外部形態(tài);隨后通過(guò)顯微技術(shù)觀察干擾后飛蝗前后腸表皮的顯微結(jié)構(gòu),為探索這兩個(gè)基因在飛蝗前后腸表皮發(fā)育中的功能提供了依據(jù)。其次,為探究幾丁質(zhì)脫乙�；笇�(duì)飛蝗生態(tài)適應(yīng)性的影響,本文通過(guò)伊紅染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾飛蝗幾丁質(zhì)脫乙�；窵mCDA1和LmCDA2后是否影響伊紅染料在其表皮的分布。此外,采用Bodipy染色和GC-MS技術(shù)進(jìn)一步探究該基因?qū)χ|(zhì)運(yùn)輸和相關(guān)碳?xì)浠衔锖康挠绊?然后通過(guò)檢測(cè)對(duì)照組和干擾組對(duì)不同農(nóng)藥的敏感性和真菌的侵染程度推測(cè)該基因是否可以通過(guò)改變飛蝗表皮脂質(zhì)分布造成其對(duì)農(nóng)藥敏感性的升高,將為基于幾丁質(zhì)脫乙�；缸鳛樾滦蜌⑾x劑的研發(fā)靶標(biāo)提供了重要的理論依據(jù)。本文主要從以下兩個(gè)方面進(jìn)行研究:一、幾丁質(zhì)脫乙�；富�?qū)︼w蝗腸道表皮發(fā)育的影響采用RT-qPCR技術(shù)確定飛蝗幾丁質(zhì)脫乙�；�(LmCDA1和LmCDA2)在飛蝗五齡前腸和后腸每一天的表達(dá)模式,結(jié)果表明LmCDA1和LmCDA2均在飛蝗前腸蛻皮前期和蛻皮之后的表達(dá)量較高,而其僅在后腸蛻皮前期的表達(dá)量比較高。采用RNA干擾技術(shù),在飛蝗五齡第二天注射雙鏈RNA沉默LmCDA1和LmCDA2后,掃描光鏡下解剖的腸道的外部形態(tài),結(jié)果顯示與對(duì)照相比并無(wú)肉眼可見的差異表型。HE染色后發(fā)現(xiàn)干擾這兩個(gè)基因后并不影響前后腸的正常蛻皮,但是干擾飛蝗LmCDA2后導(dǎo)致飛蝗五齡第六七天的前、后腸的舊表皮和第八天的新表皮更厚;利用免疫組化技術(shù)進(jìn)行飛蝗LmCDA1和LmCDA2在飛蝗前后腸表皮的定位,結(jié)果顯示LmCDA1和LmCDA2在其腸道中的定位出現(xiàn)了分化:LmCDA1主要分布在前后腸表皮的細(xì)胞質(zhì)和原表皮中,而LmCDA2主要分布在細(xì)胞質(zhì)和上表皮中。二、幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因?qū)︼w蝗體表脂成分的影響采用伊紅染料對(duì)五齡飛蝗體表進(jìn)行著色,發(fā)現(xiàn)干擾LmCDA1和LmCDA2后的蟲體表皮與對(duì)照組相比均有不同程度的伊紅著色現(xiàn)象,推測(cè)這兩個(gè)基因影響了飛蝗表皮的通透性;利用結(jié)合中性脂質(zhì)的Bodipy染料對(duì)飛蝗二齡若蟲表皮進(jìn)行著色,激光共聚焦下觀察表皮附近的脂滴分布,結(jié)果顯示與對(duì)照相比,干擾LmCDA1和LmCDA2的飛蝗表皮外的脂滴數(shù)量明顯減少,主要富集在表皮內(nèi)靠近表皮的部位;采用GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)檢測(cè)對(duì)照組和注射雙鏈RNA后的二齡若蟲表皮碳?xì)浠衔锏某煞趾秃?結(jié)果表明干擾LmCDA1后飛蝗體表碳?xì)浠衔锏目偭匡@著性的升高,推測(cè)干擾LmCDA1后飛蝗表皮碳?xì)浠衔锎鷥斝栽龈?干擾LmCDA2后飛蝗表皮碳?xì)浠衔镂闯霈F(xiàn)顯著變化;最后將五種農(nóng)藥通過(guò)點(diǎn)滴的方式作用于未干擾和分別干擾了LmCDA1和LmCDA2的二齡若蟲,檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)5種農(nóng)藥的敏感性,發(fā)現(xiàn)干擾兩個(gè)基因后均對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥敏感性增強(qiáng)且真菌侵染程度減弱。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S433.2
【圖文】：

還會(huì)造成環(huán)境的嚴(yán)重污染[2]。近年來(lái)，由于全球頻繁出現(xiàn)異常的氣業(yè)生態(tài)環(huán)境的改變，蝗災(zāi)更易發(fā)生；且蝗災(zāi)具有爆發(fā)性，爆發(fā)后很業(yè)造成不可衡量的損失，所以研發(fā)新型綠色無(wú)污染的殺蟲劑是當(dāng)前[3]。丁質(zhì)簡(jiǎn)介丁質(zhì)（chitin）是由 N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）通過(guò)β-l, 4 糖苷鍵連糖多聚物[4, 5]（化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖 1-1）。幾丁質(zhì)是自然界資源最豐富，再生的天然聚合物之一，是僅次于纖維素的高聚化合物[6]。它常見于的細(xì)胞壁和大多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物中[7]。在昆蟲體內(nèi)，幾丁質(zhì)主要存在于化道的圍食膜和體內(nèi)某些特定組織中[8]。幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)之間以規(guī)律壓形成緊密的螺旋結(jié)構(gòu)，最后平行排列形成幾丁質(zhì)[9]，有保持昆蟲的外源病原微生物入侵的作用。因?yàn)閹锥≠|(zhì)廣泛存在于昆蟲體內(nèi)，所作為害蟲生物防治靶標(biāo)之一。

飛蝗幾丁質(zhì)脫乙�；笇�(duì)腸道表皮發(fā)育和體表脂成分的影響需要蛻去舊表皮，然后合成新表皮以滿足軀體生長(zhǎng)的需要。在新舊表皮的合成過(guò)程中有很多酶系的參與，其中幾丁質(zhì)脫乙�；冈趲锥≠|(zhì)降解過(guò)程中起了很的作用[10]。幾丁質(zhì)脫乙�；福╟hitin deacetylase）簡(jiǎn)稱 CDAs，是一種糖酯酶家族的金[11]，它可以使幾丁質(zhì)脫乙�；�，將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為不同程度去乙�；膸锥≠|(zhì)，殼聚糖[5]（反應(yīng)過(guò)程如圖 1-2），CDAs 在幾丁質(zhì)代謝中起重要作用。

圖 1-3 飛蝗消化道顯微結(jié)構(gòu)觀察（A）和前胃結(jié)構(gòu)橫切圖（B）Fig 1-3 Microstructure of the inner alimentary canal（A）and Proventriculus cross-section map（B）飛蝗的后腸位于腸道的最后端，具有重吸收水分和排除食物殘?jiān)墓δ躘24]。主要由三部分組成，分別是回腸（Il）、結(jié)腸（Co）和直腸（Re）。幽門彟以下的部分是回腸，回腸呈無(wú)色透明的膜質(zhì)，是前粗后細(xì)的杯狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部無(wú)齒有褶皺[30]，具有消化吸收的作用，平均長(zhǎng)度為 4.0 mm，占消化道的 10.5%。結(jié)腸位于回腸之后，呈棕褐色，有明顯的彎曲，由六條排列規(guī)則的縱行脊組成，內(nèi)壁有齒，褶皺較多[31]，具有吸收水分的作用，平均長(zhǎng)度為 2.8 mm，占消化道的 7.4%。直腸是腸道末端的膨大部分，有 6 條延伸的棕色縱肌，縱肌之間有 6 個(gè)無(wú)色透明的膜質(zhì)結(jié)構(gòu)，稱為直腸墊，平均長(zhǎng)度為 4.67 mm，占消化道的 12.3%。在顯微鏡下，可看到后腸的腸壁結(jié)構(gòu)由內(nèi)到外依次是幾丁質(zhì)層、細(xì)胞層、環(huán)肌和縱肌[32]（如圖 1-4）。

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本文編號(hào)：2758065