【摘要】：蜜蜂白堊病是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)引起的昆蟲真菌性病害,一旦發(fā)病對(duì)蜂業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。我們?cè)谝酝膶?shí)驗(yàn)中,我們采用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因整合技術(shù)(REMI),獲得了多個(gè)蜜蜂球囊菌(A.apis)突變體,并通過蜂群接種和實(shí)驗(yàn)室人工飼喂幼蟲接種病原球囊菌孢子的方法,已經(jīng)篩選出與野生型球囊菌存在著較大的致病性差異的突變株,然而目前未止,對(duì)球囊菌致病性差異的機(jī)理尚未明確。為了深入研究蜜蜂球囊菌的致病機(jī)理,我們?cè)谇捌谝呀?jīng)獲得的穩(wěn)定遺傳的球囊菌突變體的基礎(chǔ)上,采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法,對(duì)致病性不同的3株蜜蜂球囊菌及野生型初始菌的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序,對(duì)球囊菌致病相關(guān)基因進(jìn)行了分析,初步探討了蜜蜂球囊菌致病性的分子機(jī)理。主要研究結(jié)果如下。1.采用Illumina測(cè)序技術(shù),對(duì)及野生型初發(fā)菌WT和前期采用REMI突變技術(shù)獲得的3株致病性不同的球囊菌突變體M1、M4、M7進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組de novo測(cè)序,對(duì)序列進(jìn)行了組裝和注釋。結(jié)果表明,所測(cè)定的野生型菌株WT以及3株弱致病性突變體菌株M1、M4、M7及共產(chǎn)生了394,910,604 reads,獲得了12,989 unigene,N50為853 bp。BLASTx搜索結(jié)果表明,9,598個(gè)基因可以被注釋為已知基因(UniProt庫(kù),E-value≤1.0E-05),7,807個(gè)基因可以得到有效注釋(Interpro庫(kù))。對(duì)6,583進(jìn)行了Gene Ontology(GO)分析,其中2,521個(gè)基因可以分為三大類。蛋白質(zhì)家庭數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn),6,561個(gè)基因與已知蛋白相似,其中230個(gè)蛋白有效進(jìn)行了COG分類和注釋。另外,KEGG富集結(jié)果表明,2503個(gè)基因有效富集到314個(gè)通路,其中發(fā)現(xiàn)了356個(gè)真菌特異轉(zhuǎn)錄因子(TF),而這些轉(zhuǎn)錄因子可以分在32個(gè)蛋白家族,預(yù)示著這些基因在蜜蜂球囊菌致病過程中具有重要的作用。2.對(duì)蜜蜂球囊菌3個(gè)致病性變異突變體與野生型菌株進(jìn)行了差異表達(dá)基因(DEGs)分析。結(jié)果表明,在全部的172,3,996個(gè)DEG中有650個(gè)基因上調(diào)表達(dá),同野生型相比,M1,M4,M7分別有4,403,2,845和3,016個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。挖掘出大量在不同處理間出現(xiàn)表達(dá)差異的致病性相關(guān)基因,而這些基因也正是在弱致病性的突變體中下調(diào)表達(dá)的基因。同WT野生型相比,在3個(gè)突變體中有53個(gè)水解酶基因、54個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,25個(gè)細(xì)胞壁合成降解相關(guān)基因,分別在M1、M7和M4中下調(diào)表達(dá),且M1、M7下調(diào)表達(dá)的程度大于M4。研究表明,在水解酶作用下,致病菌可有效地完成對(duì)宿主細(xì)胞的侵入和逃逸過程,是一類重要的致病相關(guān)蛋白。轉(zhuǎn)錄起始因子也一是類重要的致病相關(guān)蛋白,在轉(zhuǎn)錄調(diào)控上對(duì)致病菌的致病性發(fā)生作用。細(xì)胞壁合成與降解相關(guān)基因?qū)?xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)起著十分重要的作用,通過這些基因與宿主細(xì)胞的相互作用,可以有效保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境壓力,在外界環(huán)境脅迫下,可保護(hù)宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化,細(xì)胞形態(tài)不發(fā)生改變。采用qRT-PCR方法對(duì)3個(gè)突變體中的12個(gè)下調(diào)基因進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致。3.對(duì)蜜蜂球囊菌3個(gè)突變體與野生型菌株的差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO富集和KEGG富集。結(jié)果表明,同野生型相比,M1、M4、M7分別有811,691和660個(gè)基因有效GO富集,篩選出了一些與致病性密切相關(guān)的基因。KEGG途徑富集分析顯示,與野生型相比,在三個(gè)突變體中共富集到9個(gè)途徑中的216個(gè)基因被下調(diào)。其中,已知的5種涉及真菌致病性的途徑通過隨機(jī)突變被抑制(M1突變體含有3種,M7突變體含有2種)。同野生型相比,甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸代謝通路(28基因)以及aminoacyl-tRNA合成通路(31基因)是在M1中特異表達(dá)的通路。另外,M1與M4相比,真核生物核糖體生物合成通路這一通路中有54個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。與野生型相比,M7中Fatty acid metabolism通路(17 genes)下調(diào)表達(dá)。與M4相比,M7中基部轉(zhuǎn)運(yùn)因子通路中有21個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。4.研究發(fā)現(xiàn),在蜜蜂球囊菌3個(gè)突變體中,M1和M7的致病性要小于M4,而3個(gè)突變體的致病性均小于野生型球囊菌,轉(zhuǎn)錄組KEGG富集分析和GO富集數(shù)據(jù)分析結(jié)果與體外接種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致,相關(guān)基因的差異表達(dá)也與體外接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。綜上所述,本研究對(duì)球囊菌致病性不同的突變體及野生型菌株的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析,篩選出與蜜蜂球囊菌致病性相關(guān)基因并進(jìn)行了驗(yàn)證,對(duì)蜜蜂球囊菌致病性分子機(jī)理進(jìn)行了初步探討。研究結(jié)果為今后進(jìn)一步開展蜜蜂球囊菌致病基因功能奠定了基礎(chǔ),對(duì)有效防控蜜蜂白堊病具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S895.137

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本文編號(hào)：2756608