【摘要】：昆蟲觸角內(nèi)的氣味結合蛋白(Odorant binding proteins,OBPs)可以特異性地結合和運輸氣味分子,是昆蟲嗅覺感受的第一個環(huán)節(jié),以OBPs為靶標篩選昆蟲行為活性物質(zhì)是反向化學生態(tài)學的重要研究內(nèi)容。目前的研究表明,僅依靠傳統(tǒng)的熒光競爭結合實驗檢測OBPs與氣味分子的結合能力,缺乏對結合過程中更多特性,尤其是蛋白構象轉變的檢測,影響了OBPs作用機制的研究。同時,昆蟲體內(nèi)眾多OBPs基因在不同生理狀態(tài)下有序表達協(xié)同作用,是昆蟲嗅覺特異性識別的重要基礎。轉錄調(diào)控是基因表達調(diào)控的第一步,然而目前尚沒有報道某些轉錄因子可以控制OBPs基因的轉錄,導致OBPs在嗅覺識別上的協(xié)同作用、OBPs表達與昆蟲發(fā)育及環(huán)境變化之間的關系仍缺少分子生物學解釋。以上問題也進一步限制了以OBPs為靶標的反向化學生態(tài)學的發(fā)展。為此,本項目以林業(yè)上重要害蟲松褐天牛Monochamus alternatus Hope及其天敵花絨寄甲Dastarcus helophoroides(Fairmaire)為研究對象,對花絨寄甲觸角內(nèi)高表達的DhelOBP21與氣味物質(zhì)的結合機制進行分析,對松褐天牛觸角內(nèi)已經(jīng)明確嗅覺功能的MaltOBP19的轉錄調(diào)控機制進行了探索。以期為探明昆蟲OBPs與氣味物質(zhì)的結合機制及OBPs轉錄調(diào)控機理提供理論依據(jù),為探索利用OBPs篩選高效誘劑的研制及基于嗅覺調(diào)控的害蟲治理技術提供新的靶標。主要的研究結果如下:1花絨寄甲氣味結合蛋白DhelOBP21與氣味分子的結合機制克隆獲得花絨寄甲DhelOBP21基因cDNA序列(GenBank登陸號為KF984184)。經(jīng)qPCR進行時空表達譜分析,DhelOBP21基因主要表達在未交配期的花絨寄甲成蟲觸角內(nèi),隨著交配和產(chǎn)卵行為的發(fā)生,觸角內(nèi)基因表達量呈顯著下降趨勢。利用計算機手段對DhelOBP21進行同源建模和分子對接。結果顯示,DhelOBP21蛋白結構內(nèi)部中心位置,存在一個開放的疏水性結合腔。結合腔的大部分區(qū)域為疏水非極性區(qū)域,僅在第67位(除去信號肽后)的絲氨酸殘基處,由絲氨酸的羥基作用形成一個極性區(qū)域。設計突變蛋白,將絲氨酸(Ser67)突變?yōu)榉菢O性氨基酸丙氨酸(Ala),以增強疏水作用,分別將84位異亮氨酸(Ile84)和119位蘇氨酸(Thr119)突變?yōu)樘於０?Asn),以減弱疏水作用。熒光競爭結合實驗表明,配基體積大小是選擇性結合的首要條件,蛋白與配基的結合主要依賴于疏水相互作用和范德華力,氫鍵在結合過程中沒有起到增強結合能力的作用。DhelOBP21對配基的結合,并不是由某一個氨基酸決定的,而是受到構成結合腔的所有氨基酸共同影響,單個氨基酸的突變,導致了蛋白結合腔的大小和形狀均發(fā)生改變,進而影響了與配基的結合能力。在酸性條件下,未突變蛋白DhelOBP21-WT對配基的結合能力普遍降低,增強結合腔疏水性的突變蛋白DhelOBP21-S67A對配基的結合能力普遍增強,被突變的極性區(qū)域可能在配基釋放過程中發(fā)揮作用。2以花絨寄甲氣味結合蛋白DhelOBP21為靶標篩選行為活性物質(zhì)利用熒光猝滅、圓二色譜實驗對蛋白與配基的結合特性進行進一步檢測。在熒光競爭結合實驗中與OBPs具有結合能力的12個配基中,5個配基與DhelOBP21蛋白之間的作用屬于靜態(tài)猝滅,即能夠形成穩(wěn)定的復合物,其余配基與DhelOBP21蛋白之間的作用屬于動態(tài)猝滅,沒有形成穩(wěn)定的復合物。圓二色譜檢測顯示DhelOBP21蛋白溶液中的主要蛋白結構是α螺旋。中性環(huán)境下,部分配基的加入可以誘導蛋白溶液中的α螺旋含量升高,驗證了DhelOBP21分子動力學模擬的結果。在某些配基的結合過程中,原本游離的N端逐漸形成α螺旋并向結合腔靠攏,像“蓋子”一樣將配基固定在結合腔內(nèi),且進一步穩(wěn)定了以α螺旋為主要二級結構的蛋白構象。綜合分析不同配基是否能夠與蛋白形成穩(wěn)定復合物及是否能夠誘導α螺旋的含量升高兩個因素,篩選到(+)-β-pinene進行Y型嗅覺儀行為選擇實驗。結果表明(+)-β-pinene對未交配期的花絨寄甲具有顯著的引誘活性。沉默DhelOBP21基因后,花絨寄甲對(+)-β-pinene的趨性行為消失,說明DhelOBP21在花絨寄甲對(+)-β-pinene的識別過程中發(fā)揮了重要作用。3松褐天牛MaltOBP19轉錄調(diào)控機制克隆獲得松褐天牛MaltOBP19基因上游啟動子調(diào)控序列(948bp),提交至JASPAR數(shù)據(jù)庫預測MaltOBP19基因啟動子區(qū)的順式作用元件,共預測10個轉錄因子100%相似的作用元件,共計38個作用位點。利用雙熒光素酶實驗和序列截短實驗在果蠅S2細胞中鑒定不同序列長度啟動子的活性,其中MaltOBP19啟動子-515~-312區(qū)域存在增強轉錄活性的順式作用元件。對該區(qū)域進一步分析發(fā)現(xiàn),-474~-433之間存在抑制轉錄活性的順式作用元件,-349~-312之間存在增強轉錄活性的順式作用元件。該結果預示了MaltOBP19復雜的調(diào)控機制。根據(jù)JASPAR數(shù)據(jù)庫預測結果和相關轉錄因子功能的研究報道,選擇可能作用在-405~-349區(qū)域內(nèi)的轉錄因子BarH1,進一步驗證其對MaltOBP19啟動子的調(diào)控作用。克隆獲得了松褐天牛MaltBarH1基因,利用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)和真核表達載體,在果蠅S2細胞中超表達MaltBarH1。超表達之后的細胞相對于對照組,啟動子-405區(qū)域的轉錄活性受到顯著抑制,說明MaltBarH1對其有負調(diào)控作用。同時獲得體外MaltBarH1可溶性重組蛋白進行EMSA實驗,結果顯示MaltBarH1可溶性重組蛋白可以與探針結合,形成滯后帶,且其滯后現(xiàn)象可以被冷競爭探針完全抑制,說明探針遷移滯后是由于MaltBarH1重組蛋白與探針的互作導致的。該結果通過體外實驗初步證明了轉錄因子MaltBarH1對MaltOBP19基因啟動子序列的轉錄調(diào)控作用。綜上所述,對OBPs嗅覺功能的研究及以其為靶標進行行為活性物的篩選,需要依靠更多的結合特性數(shù)據(jù),及基于結合機制的蛋白構象轉變的分析,有助于更為準確地研究OBPs與氣味分子的作用特點,提高活性物質(zhì)的篩選效率。初步鑒定到轉錄因子MaltBarH1對MaltOBP19的轉錄具有調(diào)控作用,該研究是OBPs基因表達調(diào)控研究的基礎工作,將為深入了解昆蟲OBPs基因時空表達與嗅覺功能的相關性奠定分子生物學基礎,且隨著RNAi技術在農(nóng)業(yè)害蟲防治中的發(fā)展,以OBPs轉錄因子為靶標,將是干擾昆蟲嗅覺反應的新選擇。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S763.306.4;S763.38
【圖文】：

. DhelOBP21 基因 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝1. Electrophoresis of DhelOBP21 PCR 轉錄組數(shù)據(jù)一致，GenBank 登陸 基因含有 405bp 堿基對，編碼了/services/SignalP/）預測，其信號http://web.expasy.org/compute_pi蛋白。在 NCBI 上獲得與其氨基氨基酸序列比對分析（圖 2-3），該的其他 OBPs 相一致，屬于 Min

圖 2-2. 花絨寄甲 DhelOBP21 核苷酸序列及推導的氨基酸序列止密碼子，下劃線標識預測的信號肽，圓形方框標識保守的半胱氨酸殘基。re 2-2. Nucleotide and deduced amino acid sequences of DhelOBP21 cDNAfohelophoroidestop codon is indicated by a asterisk, underlined sequence at the N-termini shows predicted siative cystein labeled in black circle respectively.

34圖 2-3. 花絨寄甲 DhelOBP21 與其他昆蟲 OBPs 氨基酸的序列比對Fig. 2-3. The multiple sequences alignment between sequence DhelOBP21 of Dastarcus helophorowith the amino acid sequences of other insects注：基因序列來源及 GenBank 登陸號如下：Note: the gene ID in GenBank as follows:Anopheles darlingi (AdarOBP, ETN64377.1) \ Agrotis ipsilon (AipsOBP5, AGR39568.1) \ Batocera horsf(BhorOBP3,ADD82416.1) \ Batocera horsfieldi (BhorOBP4,ADD82417.1) \ Dendrolimushoui (DhouOBP,AII0098\ Dendrolimus kikuchii (DkikOBP,AII01006.1) \ Danaus plexippus (DpleOBP, EHJ66992.1) \ Dendroctonus ponder(DponOBP29, AGI05182.1) \ Dendroctonus ponderosae (DponOBP30, AGI05176.1) \ Helicoverpa armi(HarmOBP17, AFI57166.1) \ Helicoverpa assulta (HassOBP17, AGC92792.1) \ Monochamus alternatus (MaltOBAHA39267.1) \ Monochamus alternatus (MaltOBP3,AHA39268.1) \ Monochamusalternatus (MaltOBP5,AHA392\ Manduca sexta (MsexABP8, AAL60426.1) \ Spodoptera exigua (SexiOBP, ADY17884.1) \ Spodoptera ex(SexiOBP9, AGH70105.1) \ Tribolium castaneum (TcasOBP6, EFA04594.1) \ Tribolium castaneum (TcasOBEFA07544.1)\ Tribolium castaneum (TcasOBP02, EFA07545.1) \ Tribolium castaneum (TcasOBP05, EFA07543Tribolium castaneum (TcasOBP06, EFA07548.1) \ Tribolium castaneum (TcasOBP09, EFA07429.1)

【參考文獻】

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本文編號：2756575