發(fā)布時(shí)間：2020-07-15 13:54

【摘要】：昆蟲(chóng)觸角內(nèi)的氣味結(jié)合蛋白(Odorant binding proteins,OBPs)可以特異性地結(jié)合和運(yùn)輸氣味分子,是昆蟲(chóng)嗅覺(jué)感受的第一個(gè)環(huán)節(jié),以O(shè)BPs為靶標(biāo)篩選昆蟲(chóng)行為活性物質(zhì)是反向化學(xué)生態(tài)學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。目前的研究表明,僅依靠傳統(tǒng)的熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OBPs與氣味分子的結(jié)合能力,缺乏對(duì)結(jié)合過(guò)程中更多特性,尤其是蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的檢測(cè),影響了OBPs作用機(jī)制的研究。同時(shí),昆蟲(chóng)體內(nèi)眾多OBPs基因在不同生理狀態(tài)下有序表達(dá)協(xié)同作用,是昆蟲(chóng)嗅覺(jué)特異性識(shí)別的重要基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的第一步,然而目前尚沒(méi)有報(bào)道某些轉(zhuǎn)錄因子可以控制OBPs基因的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致OBPs在嗅覺(jué)識(shí)別上的協(xié)同作用、OBPs表達(dá)與昆蟲(chóng)發(fā)育及環(huán)境變化之間的關(guān)系仍缺少分子生物學(xué)解釋。以上問(wèn)題也進(jìn)一步限制了以O(shè)BPs為靶標(biāo)的反向化學(xué)生態(tài)學(xué)的發(fā)展。為此,本項(xiàng)目以林業(yè)上重要害蟲(chóng)松褐天牛Monochamus alternatus Hope及其天敵花絨寄甲Dastarcus helophoroides(Fairmaire)為研究對(duì)象,對(duì)花絨寄甲觸角內(nèi)高表達(dá)的DhelOBP21與氣味物質(zhì)的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行分析,對(duì)松褐天牛觸角內(nèi)已經(jīng)明確嗅覺(jué)功能的MaltOBP19的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探索。以期為探明昆蟲(chóng)OBPs與氣味物質(zhì)的結(jié)合機(jī)制及OBPs轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù),為探索利用OBPs篩選高效誘劑的研制及基于嗅覺(jué)調(diào)控的害蟲(chóng)治理技術(shù)提供新的靶標(biāo)。主要的研究結(jié)果如下:1花絨寄甲氣味結(jié)合蛋白DhelOBP21與氣味分子的結(jié)合機(jī)制克隆獲得花絨寄甲DhelOBP21基因cDNA序列(GenBank登陸號(hào)為KF984184)。經(jīng)qPCR進(jìn)行時(shí)空表達(dá)譜分析,DhelOBP21基因主要表達(dá)在未交配期的花絨寄甲成蟲(chóng)觸角內(nèi),隨著交配和產(chǎn)卵行為的發(fā)生,觸角內(nèi)基因表達(dá)量呈顯著下降趨勢(shì)。利用計(jì)算機(jī)手段對(duì)DhelOBP21進(jìn)行同源建模和分子對(duì)接。結(jié)果顯示,DhelOBP21蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部中心位置,存在一個(gè)開(kāi)放的疏水性結(jié)合腔。結(jié)合腔的大部分區(qū)域?yàn)槭杷菢O性區(qū)域,僅在第67位(除去信號(hào)肽后)的絲氨酸殘基處,由絲氨酸的羥基作用形成一個(gè)極性區(qū)域。設(shè)計(jì)突變蛋白,將絲氨酸(Ser67)突變?yōu)榉菢O性氨基酸丙氨酸(Ala),以增強(qiáng)疏水作用,分別將84位異亮氨酸(Ile84)和119位蘇氨酸(Thr119)突變?yōu)樘於０?Asn),以減弱疏水作用。熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明,配基體積大小是選擇性結(jié)合的首要條件,蛋白與配基的結(jié)合主要依賴(lài)于疏水相互作用和范德華力,氫鍵在結(jié)合過(guò)程中沒(méi)有起到增強(qiáng)結(jié)合能力的作用。DhelOBP21對(duì)配基的結(jié)合,并不是由某一個(gè)氨基酸決定的,而是受到構(gòu)成結(jié)合腔的所有氨基酸共同影響,單個(gè)氨基酸的突變,導(dǎo)致了蛋白結(jié)合腔的大小和形狀均發(fā)生改變,進(jìn)而影響了與配基的結(jié)合能力。在酸性條件下,未突變蛋白DhelOBP21-WT對(duì)配基的結(jié)合能力普遍降低,增強(qiáng)結(jié)合腔疏水性的突變蛋白DhelOBP21-S67A對(duì)配基的結(jié)合能力普遍增強(qiáng),被突變的極性區(qū)域可能在配基釋放過(guò)程中發(fā)揮作用。2以花絨寄甲氣味結(jié)合蛋白DhelOBP21為靶標(biāo)篩選行為活性物質(zhì)利用熒光猝滅、圓二色譜實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白與配基的結(jié)合特性進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。在熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中與OBPs具有結(jié)合能力的12個(gè)配基中,5個(gè)配基與DhelOBP21蛋白之間的作用屬于靜態(tài)猝滅,即能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物,其余配基與DhelOBP21蛋白之間的作用屬于動(dòng)態(tài)猝滅,沒(méi)有形成穩(wěn)定的復(fù)合物。圓二色譜檢測(cè)顯示DhelOBP21蛋白溶液中的主要蛋白結(jié)構(gòu)是α螺旋。中性環(huán)境下,部分配基的加入可以誘導(dǎo)蛋白溶液中的α螺旋含量升高,驗(yàn)證了DhelOBP21分子動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果。在某些配基的結(jié)合過(guò)程中,原本游離的N端逐漸形成α螺旋并向結(jié)合腔靠攏,像“蓋子”一樣將配基固定在結(jié)合腔內(nèi),且進(jìn)一步穩(wěn)定了以α螺旋為主要二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白構(gòu)象。綜合分析不同配基是否能夠與蛋白形成穩(wěn)定復(fù)合物及是否能夠誘導(dǎo)α螺旋的含量升高兩個(gè)因素,篩選到(+)-β-pinene進(jìn)行Y型嗅覺(jué)儀行為選擇實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明(+)-β-pinene對(duì)未交配期的花絨寄甲具有顯著的引誘活性。沉默DhelOBP21基因后,花絨寄甲對(duì)(+)-β-pinene的趨性行為消失,說(shuō)明DhelOBP21在花絨寄甲對(duì)(+)-β-pinene的識(shí)別過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。3松褐天牛MaltOBP19轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制克隆獲得松褐天牛MaltOBP19基因上游啟動(dòng)子調(diào)控序列(948bp),提交至JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)MaltOBP19基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件,共預(yù)測(cè)10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子100%相似的作用元件,共計(jì)38個(gè)作用位點(diǎn)。利用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和序列截短實(shí)驗(yàn)在果蠅S2細(xì)胞中鑒定不同序列長(zhǎng)度啟動(dòng)子的活性,其中MaltOBP19啟動(dòng)子-515~-312區(qū)域存在增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的順式作用元件。對(duì)該區(qū)域進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),-474~-433之間存在抑制轉(zhuǎn)錄活性的順式作用元件,-349~-312之間存在增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的順式作用元件。該結(jié)果預(yù)示了MaltOBP19復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。根據(jù)JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子功能的研究報(bào)道,選擇可能作用在-405~-349區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子BarH1,進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)MaltOBP19啟動(dòng)子的調(diào)控作用�？寺～@得了松褐天牛MaltBarH1基因,利用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)和真核表達(dá)載體,在果蠅S2細(xì)胞中超表達(dá)MaltBarH1。超表達(dá)之后的細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照組,啟動(dòng)子-405區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性受到顯著抑制,說(shuō)明MaltBarH1對(duì)其有負(fù)調(diào)控作用。同時(shí)獲得體外MaltBarH1可溶性重組蛋白進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示MaltBarH1可溶性重組蛋白可以與探針結(jié)合,形成滯后帶,且其滯后現(xiàn)象可以被冷競(jìng)爭(zhēng)探針完全抑制,說(shuō)明探針遷移滯后是由于MaltBarH1重組蛋白與探針的互作導(dǎo)致的。該結(jié)果通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步證明了轉(zhuǎn)錄因子MaltBarH1對(duì)MaltOBP19基因啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。綜上所述,對(duì)OBPs嗅覺(jué)功能的研究及以其為靶標(biāo)進(jìn)行行為活性物的篩選,需要依靠更多的結(jié)合特性數(shù)據(jù),及基于結(jié)合機(jī)制的蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變的分析,有助于更為準(zhǔn)確地研究OBPs與氣味分子的作用特點(diǎn),提高活性物質(zhì)的篩選效率。初步鑒定到轉(zhuǎn)錄因子MaltBarH1對(duì)MaltOBP19的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用,該研究是OBPs基因表達(dá)調(diào)控研究的基礎(chǔ)工作,將為深入了解昆蟲(chóng)OBPs基因時(shí)空表達(dá)與嗅覺(jué)功能的相關(guān)性奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ),且隨著RNAi技術(shù)在農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治中的發(fā)展,以O(shè)BPs轉(zhuǎn)錄因子為靶標(biāo),將是干擾昆蟲(chóng)嗅覺(jué)反應(yīng)的新選擇。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S763.306.4;S763.38
【圖文】：

. DhelOBP21 基因 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝1. Electrophoresis of DhelOBP21 PCR 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，GenBank 登陸 基因含有 405bp 堿基對(duì)，編碼了/services/SignalP/）預(yù)測(cè)，其信號(hào)http://web.expasy.org/compute_pi蛋白。在 NCBI 上獲得與其氨基氨基酸序列比對(duì)分析（圖 2-3），該的其他 OBPs 相一致，屬于 Min

圖 2-2. 花絨寄甲 DhelOBP21 核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列止密碼子，下劃線(xiàn)標(biāo)識(shí)預(yù)測(cè)的信號(hào)肽，圓形方框標(biāo)識(shí)保守的半胱氨酸殘基。re 2-2. Nucleotide and deduced amino acid sequences of DhelOBP21 cDNAfohelophoroidestop codon is indicated by a asterisk, underlined sequence at the N-termini shows predicted siative cystein labeled in black circle respectively.

34圖 2-3. 花絨寄甲 DhelOBP21 與其他昆蟲(chóng) OBPs 氨基酸的序列比對(duì)Fig. 2-3. The multiple sequences alignment between sequence DhelOBP21 of Dastarcus helophorowith the amino acid sequences of other insects注：基因序列來(lái)源及 GenBank 登陸號(hào)如下：Note: the gene ID in GenBank as follows:Anopheles darlingi (AdarOBP, ETN64377.1) \ Agrotis ipsilon (AipsOBP5, AGR39568.1) \ Batocera horsf(BhorOBP3,ADD82416.1) \ Batocera horsfieldi (BhorOBP4,ADD82417.1) \ Dendrolimushoui (DhouOBP,AII0098\ Dendrolimus kikuchii (DkikOBP,AII01006.1) \ Danaus plexippus (DpleOBP, EHJ66992.1) \ Dendroctonus ponder(DponOBP29, AGI05182.1) \ Dendroctonus ponderosae (DponOBP30, AGI05176.1) \ Helicoverpa armi(HarmOBP17, AFI57166.1) \ Helicoverpa assulta (HassOBP17, AGC92792.1) \ Monochamus alternatus (MaltOBAHA39267.1) \ Monochamus alternatus (MaltOBP3,AHA39268.1) \ Monochamusalternatus (MaltOBP5,AHA392\ Manduca sexta (MsexABP8, AAL60426.1) \ Spodoptera exigua (SexiOBP, ADY17884.1) \ Spodoptera ex(SexiOBP9, AGH70105.1) \ Tribolium castaneum (TcasOBP6, EFA04594.1) \ Tribolium castaneum (TcasOBEFA07544.1)\ Tribolium castaneum (TcasOBP02, EFA07545.1) \ Tribolium castaneum (TcasOBP05, EFA07543Tribolium castaneum (TcasOBP06, EFA07548.1) \ Tribolium castaneum (TcasOBP09, EFA07429.1)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 趙新成;翟卿;王桂榮;;昆蟲(chóng)觸角葉的結(jié)構(gòu)[J];昆蟲(chóng)學(xué)報(bào);2015年02期

2 盧希平;姜莉;魏建榮;;花絨寄甲成蟲(chóng)搜索銹色粒肩天牛行為的測(cè)定[J];中國(guó)生物防治學(xué)報(bào);2012年04期

3 張鍇;梁軍;嚴(yán)冬輝;張星耀;;中國(guó)松材線(xiàn)蟲(chóng)病研究[J];世界林業(yè)研究;2010年03期

4 魏建榮;楊忠岐;唐樺;馬建海;杜家緯;;花絨寄甲成蟲(chóng)的行為觀察[J];林業(yè)科學(xué);2008年07期

5 郝德君;馬鳳林;王焱;戴華國(guó);張永慧;;松墨天牛對(duì)馬尾松揮發(fā)物的觸角電位和行為反應(yīng)[J];昆蟲(chóng)知識(shí);2007年04期

6 魏建榮;楊忠岐;馬建海;唐樺;;花絨寄甲研究進(jìn)展[J];中國(guó)森林病蟲(chóng);2007年03期

7 寧眺;樊建庭;方宇凌;孫江華;;不同危害狀態(tài)下寄主萜烯揮發(fā)物含量的變化及松墨天牛對(duì)其組分的觸角電位反應(yīng)[J];昆蟲(chóng)學(xué)報(bào);2006年02期

8 江望錦,嵇保中,劉曙雯,宋杰;天牛成蟲(chóng)信息素及嗅覺(jué)感受機(jī)制研究進(jìn)展[J];昆蟲(chóng)學(xué)報(bào);2005年03期

9 郝德君,張永慧,戴華國(guó),王焱;松墨天牛對(duì)寄主樹(shù)木的產(chǎn)卵選擇[J];昆蟲(chóng)學(xué)報(bào);2005年03期

10 楊忠岐;利用天敵昆蟲(chóng)控制我國(guó)重大林木害蟲(chóng)研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物防治;2004年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 劉乃勇;甜菜夜蛾和斜紋夜蛾P(guān)BP/GOBP的功能分化研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 任利利;松墨天牛和天敵花絨寄甲對(duì)幾種樹(shù)木揮發(fā)物的電生理及行為反應(yīng)[D];北京林業(yè)大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 喻廣強(qiáng);昆蟲(chóng)花絨寄甲氣味結(jié)合蛋白DhelOBP21的分子模擬[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 于麗穎;花絨寄甲對(duì)松褐天牛搜尋選擇行為的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2756575