【摘要】：由Valsa mali引起的蘋果樹腐爛病是危害蘋果生產最為嚴重的病害之一,該病菌主要侵染皮層和韌皮部,導致樹皮腐爛,嚴重時可致整樹枯死,但基因組序列的缺乏嚴重限制了在分子水平對其致病機理的解析。病原菌與植物長期的協(xié)同進化過程中,病菌分泌毒性蛋白來調控植物的生理過程和免疫反應以促進病菌的侵染,但這些蛋白也很容易被植物識別并激發(fā)免疫反應。利用基因組分析研究蘋果樹腐爛病菌適應性侵染定殖樹皮的機理,明確病菌分泌的毒性蛋白被植物識別的機制,將有助于理解病害的成災規(guī)律、植物的抗病機制及制定有效的防治策略。因此,本研究在完成了蘋果樹腐爛病菌基因組測序的基礎上,通過進行比較基因組分析及致病相關基因的預測鑒定,并探明了鑒定到的兩個病菌分泌蛋白VmPR1c和VmEXLX1被植物識別的機制,獲得的主要結果和結論如下:基因數量和基因水平轉移驅動蘋果樹腐爛病菌適應性定殖樹皮。利用高通量測序及光學圖譜輔助拼接,獲得了高質量的V.mali基因組序列,其完整度為96.7%,包括13條染色體級別的scaffolds。V.mali分泌蛋白酶的最適pH大多為酸性,并發(fā)現(xiàn)對真菌在酸性環(huán)境中正常生長至關重要的G01家族在V.mali基因組中顯著擴張。V.mali基因組含有大量的胞壁降解酶類,但相比其它真菌擴張的主要為果膠酶類,而降解木質纖維相關酶類相對較少,并且降解木質素的關鍵酶AA5家族基因在腐爛菌基因組中缺失;此外,大部分果膠酶基因在侵染過程顯著上調表達,經免疫細胞化學分析顯示,腐爛菌主要降解蘋果樹皮中的果膠。相比其它真菌,V.mali的次生代謝基因簇數量顯著增多,在侵染過程上調表達的主要為非核糖體多肽類基因�；蛩睫D移分析鑒定到的32個基因,功能涉及與環(huán)境微生物競爭、氮利用和致病等,可能在驅動病菌適應性定殖樹皮中發(fā)揮重要作用。Expansin-like蛋白VmEXLX1被植物SRLK識別。VmEXLX1在侵染早期上調表達,表明VmEXLX1可能是重要的致病因子。過表達該基因后,病菌的致病力顯著降低,在本氏煙中瞬時表達后誘導細胞死亡并顯著提高本氏煙對核盤菌的抗性,表明VmEXLX1可被植物識別并激發(fā)免疫反應。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn),VmEXLX1定位于植物細胞膜,并且信號肽缺失后不能在煙草中誘導細胞死亡,表明VmEXLX1很可能在質外體發(fā)揮功能。進一步利用質譜、雙分子熒光互補和免疫共沉淀分析,在本氏煙中鑒定到一個與VmEXLX1互作的受體激酶NbSRLK1。瞬時表達NbSRLK1可以誘導細胞死亡、ROS積累和胼胝質沉積,且NbSRLK1促進VmEXLX1的降解,而VmEXLX1促進NbSRLK1誘導的細胞死亡。PR1-like蛋白VmPR1c被植物Skp1降解后激發(fā)免疫反應。三個PR1-like基因在病菌侵染早期都上調表達,其中VmPR1c敲除和過表達突變體的致病力都顯著降低,且在本氏煙中瞬時表達可誘導細胞死亡、ROS積累和胼胝質沉積,表明VmPR1c被植物識別并激發(fā)免疫反應。通過刪除突變和western blot分析發(fā)現(xiàn),VmPR1c誘導的細胞死亡需要翻譯后修飾;信號肽缺失則不能誘導細胞死亡,信號肽切割位點附近的插入或刪除突變均可影響蛋白的降解、翻譯后修飾和誘導細胞死亡的能力。蛋白酶體和溶酶體抑制劑處理,都不能有效抑制VmPR1c的降解;進一步的刪除和點突變分析發(fā)現(xiàn),CAP功能域中的3個α螺旋區(qū)域單獨都能介導GFP融合蛋白的降解,而NTE和CTE功能域中的脯氨酸則起保護蛋白的作用。亞細胞定位試驗表明,VmPR1c定位于植物的細胞質和細胞核。通過酵母雙雜交篩選及雙分子熒光互補驗證,鑒定到一個蘋果的互作蛋白MdSkp1。瞬時表達分析發(fā)現(xiàn),MdSkp1可以顯著促進VmPR1c的降解及其誘導的細胞死亡,并且VmPR1c不能在沉默NbSkp1的本氏煙中誘導細胞死亡,表明Skp1識別并介導了VmPR1c誘導的細胞死亡。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S436.611.11
【圖文】：

因組學分析不僅發(fā)現(xiàn)毒性基因通常位于活躍的基因組區(qū)域，還發(fā)現(xiàn)基因水平物病原真菌的基因組重塑具有重要作用。一個寄主特異性蛋白類毒素基因 To 個 hAT 轉 座 酶 基 因 被 發(fā) 現(xiàn) 從 S. nodorum 水 平 轉 移 到 Pyreni-repentis(Friesen et al., 2006)。除了基因水平轉移，最新研究發(fā)現(xiàn)整個染色體也轉移。番茄致病菌 F. oxysporum 的一些特異的染色體可以從致病菌株轉移到非，進而產生新的致病菌株(Ma et al., 2010)�；蛩睫D移不僅可以在同一物種離株間發(fā)生，也可在不同物種間發(fā)生甚至跨界轉移，如細菌-真菌、真菌-卵nes & Richards, 2014)。應蛋白是病菌分泌的促進侵染定殖的蛋白，通常與寄主植物的蛋白發(fā)生互作序列的完成，極大地加快了新的效應蛋白的鑒定。效應蛋白通常是小的分泌功能未知(Rep, 2005)。候選效應蛋白通常從蛋白組序列中預測得到（圖 1-1）, 2016)。然而，大量基于基因組學分析鑒定到的候選基因仍缺乏深入的研究。列為預測鑒定重要毒性基因提供了寶貴資源，而進一步的基因功能分析（如反）將有助于明確這些基因的功能。

物病原真菌 Pyrenophora teres 和 Pyrenophora tritici-repentis 基因組中只鑒定到 16 個HGTs，占基因總數的 0.1%(Sun et al., 2013)；在 6 個植物基因組的 4866 個基因中只鑒定到 9 個真菌相關的 HGTs，占比不到 0.2%(Richards et al., 2009)。相比細菌基因組，真菌基因組的進化主要來自于基因家族擴張、基因復制、基因缺失等(Wapinski et al., 2007)。盡管 HGT 對真菌基因組的進化影響較小，但對真菌生物學表型的影響很可能非常顯著，如提高真菌對生態(tài)環(huán)境的適應性。例如，真菌中對糖代謝和環(huán)境適應性非常重要的果糖轉運蛋白很可能經歷了多次 HGT 過程(Coelho et al., 2013)。HGT 還可以顯著影響植物病原真菌的致病性。已被試驗驗證功能的數十個真菌 HGT 在破壞植物細胞壁、利用植物營養(yǎng)、干擾植物生理過程和免疫反應等方面具有重要作用(Soanes & Richards, 2014)。真菌是滲透營養(yǎng)菌，需要通過分泌大量水解酶類降解大分子物質進而利用膜轉運蛋白獲取營養(yǎng)(Richards & Talbot, 2013)。除了獲取營養(yǎng)，植物病原真菌分泌的水解酶類還可以降解植物細胞壁以促進侵染。植物細胞壁由果膠、纖維素、半纖維素和木質素等多糖構成，是抵御病原菌入侵的物理屏障。利用生物信息方法從多個病原真菌基因組中鑒定到了多種胞壁降解酶類的 HGTs，如果膠酶、阿魏酸酯酶、木聚糖酶等（圖 1-2）(Richards& Talbot, 2013)。這些 HGTs 的獲得，很可能有利于病菌破壞植物細胞壁。

嘧茨騁?clade 內的基因包含進化關系遠的物種的基因（圖1-3）。通過系統(tǒng)發(fā)育樹 bootstrap 值的高低和基因是否發(fā)生多次的復制或缺失來判斷是否為 HGT，但基因的復制和缺失，經常導致其系統(tǒng)發(fā)育樹類似于 HGT（圖 1-4）。因此，還可以通過基因的功能注釋進一步確認。比如，進化關系較遠的物種間共有的基因，其4

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

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相關博士學位論文 前1條

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本文編號：2748171