發(fā)布時間：2020-07-10 03:39

【摘要】：雙斑側(cè)溝繭蜂(Microplitisbicoloratus)是農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾(Spodoptera litura)的天敵,通過寄生斜紋夜蛾幼蟲而抑制寄主血細(xì)胞的免疫反應(yīng)及寄主的生長發(fā)育。親環(huán)素D(Cyclophilin D,CypD)屬于親環(huán)素蛋白家族,研究表明,哺乳細(xì)胞在受到凋亡刺激時,CypD可與p53結(jié)合形成復(fù)合物,通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為探討繭蜂寄生斜紋夜蛾過程中,繭蜂病毒誘導(dǎo)寄主血細(xì)胞凋亡以抑制其細(xì)胞免疫的分子機(jī)制,本研究通過凋亡檢測、western blot、Co-IP、免疫熒光、基因沉默和線粒體膜電位檢測等實驗檢測了寄生前后及繭蜂病毒感染后CypD與p53的表達(dá)、互作、細(xì)胞凋亡及線粒體變化情況。結(jié)果顯示,繭蜂的寄生導(dǎo)致斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞p53、CypD上調(diào)及促進(jìn)CypD與p53相互作用,線粒體膜電位的下降,細(xì)胞色素C從線粒體釋放,激活了 cl-caspase 3,且寄生導(dǎo)致寄主血細(xì)胞凋亡的增加。提取繭蜂病毒MbBV感染Spli221細(xì)胞24h后,MbBV感染促進(jìn)了 CypD與p53相互作用,細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的下降,細(xì)胞色素C從線粒體釋放,激活了 cl-caspase 3同時也伴隨著細(xì)胞凋亡增加。而當(dāng)用RNAi沉默斜紋夜蛾幼蟲血細(xì)胞CypD可以挽救繭蜂寄生引起的寄主血細(xì)胞凋亡。同時,當(dāng)用CsA抑制或siRNA沉默CypD時,發(fā)現(xiàn),抑制或沉默CypD可以抑制CypD與p53相互作用,細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位有一定的恢復(fù);且CsA抑制或沉默CypD后,細(xì)胞凋亡率顯著性下降。以上結(jié)果提示,MbBV可能通過促進(jìn)CypD與p53相互作用來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。綜上所述,本研究闡明了雙斑側(cè)溝繭蜂寄生促進(jìn)了寄主血細(xì)胞CypD與p53相互作用,導(dǎo)致線粒體膜電位下降,細(xì)胞色素C從線粒體釋放,激活cl-caspase 3,最終導(dǎo)致寄主血細(xì)胞凋亡。該研究為闡明繭蜂寄生抑制寄主斜紋夜蛾免疫反應(yīng)的分子機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ),也為生物防治斜紋夜蛾提供新的研究靶點。
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S476.3
【圖文】：

需要進(jìn)一步研宄闡明。同時，在寄生前后斜紋夜蛾血細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)逡逑據(jù)中發(fā)現(xiàn)，有２９９個基因被上調(diào)了，其中與細(xì)胞凋亡有關(guān)的ＮＦ－ｋＢ、ＡＫＴ、ｐ５３、逡逑ＣｙｐＤ等基因被顯著性上調(diào)了（圖１）；其中有２４４１個基因被顯著性下降［１Ｑ】。也逡逑有研究表明，當(dāng)雙斑側(cè)溝繭蜂寄生斜紋夜幼蟲６天后，寄主血細(xì)胞中ＣｙｐＤ顯著逡逑性上調(diào)［１１，１２］，并誘導(dǎo)ｍＰＴＰ孔道開放，使細(xì)胞色素Ｃ、ＡＩＦ等凋亡誘導(dǎo)因子從線逡逑粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。其中ＡＩＦ與ＣｙｐＡ相互作用進(jìn)入細(xì)胞核中，導(dǎo)致ＤＭＡ片逡逑段化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［１３］。但是關(guān)于ＡＩＦ與ＣｙｐＡ是如何進(jìn)入細(xì)胞核中導(dǎo)致逡逑ＤＮＡ片段化的這一作用機(jī)制還未闡明，需要進(jìn)一步研宄。同時發(fā)現(xiàn)在雙斑側(cè)溝逡逑繭蜂寄生斜紋夜蛾后，寄主ＣｙｐＤ發(fā)生乙�；�，且ＣｙｐＤ乙�；脚c細(xì)胞凋亡逡逑有關(guān)［１２］。同時，研宄發(fā)現(xiàn)雙斑側(cè)溝繭蜂寄生斜紋夜蛾幼蟲后翻譯起始因子ｅＩＦ４Ａ逡逑在ｍＲＮＡ水平和蛋白水平均被顯著下調(diào)［１４］

３．２邋ｐ５３與細(xì)胞凋亡逡逑ＭＤＭ２作為ｐ５３的一個靶基因，可與被ｐ５３轉(zhuǎn)錄并活化表達(dá)。通常情況下，ｐ５３逡逑與ＭＤＭ２以二聚體存在，ｐ５３蛋白水平較低。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號刺激時，ｐ５３發(fā)逡逑生磷酸化修飾反應(yīng)，同時ＭＤＭ２發(fā)生磷酸化修飾反應(yīng)，導(dǎo)致ｐ５３與ＭＤＭ２之間的逡逑結(jié)合被打破，從而來穩(wěn)定ｐ５３，邋ｐ５３蛋白水平增加并產(chǎn)生后續(xù)的活化反應(yīng)。同時ｐ５３逡逑通過激活其上下游的靶基因Ｂａｘ、ｐ２１、ＧＡＤＤ４５等誘導(dǎo)Ｇ（）／Ｇｊｊｊ細(xì)胞周期的阻滯，逡逑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，修復(fù)ＤＮＡ損傷，調(diào)節(jié)細(xì)胞的衰老等生命活動當(dāng)細(xì)胞不能修逡逑復(fù)其ＤＮＡ損傷時，ｐ５３就會通過調(diào)控Ｂｄ－２和Ｂａｘ基因的表達(dá)使細(xì)胞發(fā)生凋亡逡逑Ｂｃｌ－２阻止細(xì)胞色素Ｃ等闊亡因子從線粒體釋放，從而抵抗細(xì)胞凋亡｜６Ｗ７１；而Ｂａｘ逡逑９逡逑

分別用ａｎｔｉ－ＣｙｐＤ和ａｎｔｉ－ｐ５３抗體孵育，顯影后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ＭｂＢＶ病毒感逡逑染促進(jìn)了邋ＳｐＵ２２１細(xì)胞ＣｙｐＤ與ｐ５３相互結(jié)合，且ＭｂＢＶ感染后ＣｙｐＤ與ｐ５３相逡逑互結(jié)合增強(qiáng)（圖１０Ａ）；該研宄結(jié)果與活體水平寄主血細(xì)胞的結(jié)果是一致的。逡逑同時本實驗提取繭蜂病毒ＭｂＢＶ感染Ｓｐｌｉ２２１細(xì)胞２４ｈ后，提取細(xì)胞總蛋白逡逑分離線粒體蛋白，用ａｎｔｉ－ＣｙｐＤ對總蛋白進(jìn)行免疫沉淀，將免疫沉淀產(chǎn)物進(jìn)行逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實驗，分別用ａｎｔｉ－ＣｙｐＤ和ａｎｔｉ－ｐ５３抗體解育，顯影后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：逡逑ＭｂＢＶ感染促進(jìn)了線粒體中ＣｙｐＤ與ｐ５３的相互作用且相互作用增強(qiáng)（圖１０Ｂ）。逡逑因此，我們認(rèn)為ＣｙｐＤ與ｐ５３的相互作用可能介導(dǎo)了線粒體體途徑的細(xì)胞凋亡。逡逑這一結(jié)果與繭蜂病毒ＭｂＢＶ感染下ｐＩＺＴ－ｐ５３與ｐＩＺＴ－ＣｙｐＤ在細(xì)胞中的定位由細(xì)逡逑胞核到細(xì)胞質(zhì)的變化情況是相符的。為了進(jìn)一步探討繭蜂寄生促進(jìn)斜紋夜蛾逡逑ＣｙｐＤ與ｐ５３相互作用導(dǎo)致ｍＰＴＰ孔道的開放是否由繭蜂病毒ＭｂＢＶ介導(dǎo)的，于逡逑是本實驗提取繭蜂病毒ＭｂＢＶ感染Ｓｐｌｉ２２１細(xì)胞２４ｈ后，用ＪＣ－１線粒體膜電位逡逑檢測試劑盒檢測線粒體膜電位變化情況（圖１０Ｃ），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ＭｂＢＶ感染Ｓｐｌｉ２２１逡逑細(xì)胞２４ｈ后線粒體膜電位也顯著下降（圖１０Ｄ）

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2748407