發(fā)布時(shí)間：2020-07-09 22:32

【摘要】：黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)在全球范圍內(nèi)分布廣泛,能夠在作物、觀賞植物、蔬菜等單子葉或雙子葉植物上引起嚴(yán)重的病害。CMV編碼的外殼蛋白(coat protein,CP)以及沉默抑制子2b都是多功能蛋白,主要參與病毒運(yùn)動(dòng)和癥狀決定等致病過程。本研究前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),野生型CMV(CMVWT)在侵染初期進(jìn)入寄主頂端分生組織,在侵染后期逐漸在莖尖消失,隨后新生葉片出現(xiàn)“癥狀恢復(fù)”的現(xiàn)象。然而,突變體病毒CMVRA(CP的N端R13RRRPRR19突變?yōu)檫B續(xù)的A)會(huì)持續(xù)地侵入莖尖并在頂端組織中積累較高的水平,導(dǎo)致寄主頂端優(yōu)勢的喪失。在寄主頂端組織中,CMVWT比CMVRA誘導(dǎo)更強(qiáng)的RNA沉默,暗示RNA沉默參與CP負(fù)調(diào)控CMV莖尖侵染過程。本研究首先利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),觀察到2b蛋白能夠抑制GFP誘導(dǎo)的RNA沉默,CPWT共表達(dá)能顯著減弱2b的抑制效果,而CPRA對2b的抑制能力沒有顯著影響。GFP mRNA和siRNA積累量的雜交結(jié)果表明CPWT能夠增加siRNA的產(chǎn)生效率,從而減弱2b的抑制子活性。通過接種野生型擬南芥,以及RDR6、SGS3等siRNA擴(kuò)增通路相關(guān)基因的功能缺失擬南芥突變體,發(fā)現(xiàn)CPWT主要是促進(jìn)依賴于寄主RDR6/SGS3的次級siRNA的產(chǎn)生,誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗病毒RNA沉默,從而負(fù)調(diào)控病毒的莖尖侵染。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明,CPWT的N端13-19位堿性氨基酸能夠介導(dǎo)CP非特異性結(jié)合RNA并抑制其翻譯,進(jìn)而招募RDR6/SGS3復(fù)合體誘導(dǎo)次級siRNA擴(kuò)增。CP的N端連續(xù)堿性氨基酸區(qū)域在黃瓜花葉病毒屬其它病毒也保守存在,本研究證明這些病毒的CP都能夠減弱2b的抑制子活性。此外,CMV的CP還能減弱其它沉默抑制子的功能,暗示CMV的CP在自然侵染狀態(tài)下對多種病毒協(xié)同侵染過程具有影響。前人研究表明CMVFny株系2b轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)育異常,主要是因?yàn)?b與AGO1互作并影響內(nèi)源miRNA途徑。我們進(jìn)一步在2b超表達(dá)植株中轉(zhuǎn)入CPWT,觀察到2b引起的發(fā)育異常會(huì)變?nèi)跎踔料?并且一些受2b誘導(dǎo)的內(nèi)源基因積累水平也恢復(fù)正常,說明CPWT能夠影響2b對于miRNA途徑的調(diào)控。同時(shí),CPRA共表達(dá)也能對2b的內(nèi)源miRNA調(diào)控通路具有影響,說明這些CP對2b這一功能的影響不是通過誘導(dǎo)次級siRNA的擴(kuò)增或者抑制2b蛋白的積累量等原因。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明CP與2b發(fā)生互作,進(jìn)一步減弱2b與AGO1的互作,釋放AG01并正常行使體內(nèi)miRNA通路。綜上所述,CP與2b之間的相互作用影響著病毒在寄主上的致病性。首先,CP通過促進(jìn)siRNA的產(chǎn)生效率,誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗病毒RNA沉默;同時(shí),通過翻譯抑制降低抑制子2b的積累水平,這兩方面的因素導(dǎo)致侵染后期不能進(jìn)行莖尖侵染的現(xiàn)象。其次,CP通過競爭性結(jié)合2b,減弱2b與AG01的互作,使AG01在miRNA途徑中正常發(fā)揮作用。以上兩種都是病毒自我弱化的新機(jī)制,保證了寄主相對正常的生長狀態(tài),有利于病毒的長期侵染。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S432.41
【圖文】：

在切割的過程中ｄｓＲＮＡ或者具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ初級轉(zhuǎn)錄物被ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ逡逑（Ｄｉｃｅｒ或Ｄｒｏｓｈａ）切割產(chǎn)生ｓＲＮＡＡＲＢ作為輔助因子幫助ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ完成切害ｌＵＲＮａｓｅ逡逑ＩＩＩ可以分為三類（圖１－２），其中Ｃｌａｓｓ邋Ｉ是在細(xì)菌和酵母中發(fā)現(xiàn)的，只有一個(gè)ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ逡逑催化結(jié)構(gòu)域連接著雙鏈ＲＮＡ結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ｄｓＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇ邋ｄｏｍａｉｎ，邋ｄｓＲＢＤ）；邋Ｃｌａｓｓ邋ＩＩ和逡逑Ｃｌａｓｓ邋ＩＩＩ包含兩個(gè)ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ催化結(jié)構(gòu)域，Ｃｌａｓｓ邋ＩＩＩ還含有解旋酶結(jié)構(gòu)域以及ＰＡＺ逡逑（Ｐｉｗｉ／Ａｒｇｏｎａｕｔｅ／Ｚｗｉｌｌｅ）結(jié)構(gòu)域（Ｚｈａｎｇ邋ｅｔａｌ．，邋２００４）。逡逑通過對細(xì)菌如b2ｊ／Ｚｃｍ邋（Ａａ）邋ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ以同源逡逑二聚體的形式發(fā)揮作用，同時(shí)預(yù)測了邋ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ切割ｄｓＲＮＡ的模型。ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ的ＰＡＺ逡逑結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合ｄｓＲＮＡ有兩個(gè)核苷酸的Ｙ突出端，使得兩個(gè)ＲＮａｓｅ邋ＩＩＩ結(jié)構(gòu)域距離逡逑ｄｓＲＮＡ自由端大約２０邋ｎｔ

菌的Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白進(jìn)行Ｘ－ｒａｙ晶體結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)在ＰＡＺ和ＰＩＷＩ兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間逡逑還存在ＭＩＤ第三個(gè)結(jié)構(gòu)域，ＭＩＤ結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)高度堿性的口袋，能夠特異地結(jié)合逡逑ｓＲＮＡ的５＇磷酸基團(tuán)從而將ｓｉＲＮＡ錨定到Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白中（圖１－４）邋（Ｙｕａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２００５）。逡逑根據(jù)Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白所具有的功能域可以將真核生物的Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白家族分成逡逑兩個(gè)組：ＡＧＯ邋以及邋ＰＩＷＩ邋亞家族（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ邋ａｎｄ邋Ｓｉｍａｒｄ，邋２００８）。Ａｒｇｏｎａｕｔｅ邋蛋白是一逡逑個(gè)高度保守的蛋白，但是它在不同的組織中積累量有很大的差異（Ｄｏｅｒｋｓｅｔａｌ．，邋２００２）。逡逑不同生物體編碼蛋白的數(shù)量差別也很大，比如釀酒酵母不編碼Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白，但是逡逑裂殖酵母能夠編碼一個(gè)Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白；線蟲可以編碼２７個(gè)Ａｒｇｏｎａｕｔｅ蛋白（Ｐｅｔｅｒｓ逡逑ａｎｄ邋Ｍｅｉｓｔｅｒ，邋２００７）。模式植物擬南芥能夠編碼１０個(gè)ＡＧＯ蛋白，從ＡＧ０１到ＡＧＯ１０。逡逑這１０個(gè)蛋白根據(jù)蛋白相似性被分為三類：其中ＡＧＯｌ、ＡＧ０５和ＡＧＯ１０為一類；逡逑ＡＧ０２、ＡＧ０３邋和邋ＡＧ０７邋為一類；ＡＧ０４、ＡＧ０６、ＡＧ０８邋以及邋ＡＧ０９邋為一類（Ｊｅａｎｅｔ逡逑ａｌ．，２００２）。其中ＡＧ０１、ＡＧ０２、ＡＧ０７以及ＡＧＯ１０能夠參與轉(zhuǎn)錄后基因沉默（Ｆａｎｇ逡逑ａｎｄ邋Ｑｉ，２０１６；邋Ｑｕ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００８）；邋ＡＧ０４和ＡＧ０６能夠參與轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默，參與甲逡逑基化過程（Ｈａｍｅｒａｅｔａｌ．

或者膜結(jié)構(gòu)中進(jìn)行復(fù)制來抵抗ＲＮＡ沉默，也有可能通過快速地復(fù)制以及運(yùn)動(dòng)來躲避逡逑ＲＮＡ沉默（Ｓｃｈｗａｒｔｚ邋ｅｔａｌ．，邋２００２）。不同的ＶＳＲｓ序列以及結(jié)構(gòu)之間是多樣化的，暗示逡逑它們在ＲＮＡ沉默途徑的不同過程中發(fā)揮抑制作用（圖１－５）邋（Ｃｓｏｒｂａ邋ａｎｄ邋Ｂｕｒｇｙｄｎ，邋２０１６）。逡逑不同ＶＳＲｓ發(fā)揮抑制子功能的機(jī)制可以總結(jié)為以下幾個(gè)方面：影響ｓｉＲＮＡ的產(chǎn)生以逡逑及穩(wěn)定性；影響ＲＩＳＣ復(fù)合體的形成；影響ＲＮＡ沉默信號的擴(kuò)X椀取Ｏ旅婢嚀褰檣苠義希鄭櫻曳⒒右種譜庸δ艿幕�。辶x希保保矗庇跋歟螅椋遙危戀牟約拔榷ㄐ藻義喜《廄秩局參锘崢燜儆盞跡遙危臉聊鄭櫻夷芡ü髦址絞揭種疲遙危臉聊膩義掀鶚�。在＿b危臉聊揪噸校鄭櫻醫(yī)岷纖矗螅椋遙危晾匆種疲遙危臉聊且桓齬惴旱耐懼義暇�，睙峒傇n櫻值模校保埂ⅲ茫停值模玻�、马铃薯啊毒势A模齲悖校潁鎩⑻鴆嘶ㄒ恫《懼義仙倌蹋九攏伲鄭┑囊種譜櫻校玻鋇群芏嗖《鏡模鄭櫻遙蠖寄芄喚岷纖矗螅椋遙危鈴澹ǎ粒睿洌潁澹麇義希澹翦澹幔歟�，邋２０００Ｕd澹牽酰镥澹澹翦澹幔歟垮澹玻埃保保誨澹伲邋澹澹翦澹幔歟�，邋２００３Ｕd澹伲邋澹幔睿溴澹校幔簦澹歟澹玻埃埃擔(dān)╁

本文編號：2748070