【摘要】：目的本研究通過Illumina高通量測序和生物信息學的方法,對感染CSBV的中華蜜蜂幼蟲和健康的中華蜜蜂幼蟲小RNA(s RNA)進行測序,分析和預測宿主mi RNA的差異表達、源于CSBV的si RNA(vi RNA)及其潛在的病毒mi RNA(vmi RNA),并篩選一條vmi RNA(MD17)對其功能進行初步研究,為深入研究中華蜜蜂抗CSBV病毒機制及其CSBV vmi RNA功能研究奠定基礎。方法通過高通量測序技術對構(gòu)建的CSBV感染的中華蜜蜂幼蟲(L_I)和健康中華蜜蜂幼蟲(L_H)的兩個文庫進行測序,測序數(shù)據(jù)過濾后,使用Bowtie軟件對兩個文庫的s RNA長度和分類進行注釋,以mi RBase作為參考,通過DEGseq(2010)軟件對宿主已知mi RNA表達水平進行聚類分析,并通過mi REvo和mirdeep2預測軟件預測宿主的新mi RNA。同時將得到的clean reads定位于CSBV基因組,預測病毒的vi RNA,通過RNAhybrid預測病毒vi RNA靶基因,并且使用VMIR軟件預測其潛在的mi RNA。在此基礎上,對宿主mi RNA和病毒vi RNA的靶基因進行GO功能富集和KEGG PATHWAY富集分析。利用q RT-PCR方法對預測的病毒vmi RNA前體進行檢測和驗證。同時針對靶向基因VP2的vmi RNA MD17功能進行研究,首先參照MD17成熟體序列合成si RNA,然后將si RNA與p EGFPN1-CSBV-VP2重組表達質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至293T細胞中,在細胞水平上研究MD17對CSBV VP2基因表達的影響。在此基礎上,將MD17(1μg/μL)和1×107拷貝數(shù)的CSBV共同飼喂3日齡中華蜜蜂幼蟲,通過q RT-PCR檢測幼蟲體內(nèi)CSBV拷貝數(shù),并統(tǒng)計幼蟲存活率,對MD17在CSBV感染過程中的作用進行初步探討。結(jié)果經(jīng)高通量測序,L_H和L_I兩個文庫分別獲得14,933,703和18,687,476條clean reads,長度分析結(jié)果顯示,其主要集中在22nt處,符合mi RNA的長度特征。將所獲s RNA進行分類注釋,共鑒定出151個已知的宿主mi RNA前體和預測到2個新的宿主mi RNA,同時也檢測到了源于CSBV正義鏈的s RNA有882,573個,負義鏈的s RNA有74,214個,表明感染期間CSBV基因組正義鏈和反義鏈均可產(chǎn)生s RNA。在此基礎上,對L_H和L_I兩個文庫的宿主mi RNA表達水平進行聚類分析,發(fā)現(xiàn)共有44個宿主mi RNA表達顯著差異,其中有26個mi RNA表達上調(diào),18個mi RNA表達下調(diào),經(jīng)過功能分析顯示這些mi RNA靶基因多為調(diào)控蛋白和參與信號傳導的蛋白,并以此調(diào)控代謝途徑、胞吞作用以及m RNA的降解等。通過與CSBV基因組比對分析,共鑒定出源自CSBV的vi RNA146,960個,其中差異表達的vi RNA 311個,對其靶基因進行功能分析顯示,靶向病毒的vi RNA靶基因主要與病毒感染相關,而靶向宿主的vi RNA靶基因具有與信號轉(zhuǎn)導相關酶(如GTPase酶、蛋白激酶等)結(jié)合的功能,并主要參與了宿主的代謝途徑,其次還有少量的靶基因參與了宿主的胞吞作用以及RNA降解。通過Vir-Mir軟件預測得到6條源于CSBV的vmi RNA前體,并通過q RT-PCR方法在感染CSBV幼蟲體內(nèi)檢測到6條vmi RNA前體,測序結(jié)果均與預測的序列完全匹配。進一步分析發(fā)現(xiàn),MR3、MD17定位于結(jié)構(gòu)蛋白基因,MR10、MD18、MD27、MD35定位于非編碼區(qū)。對靶向VP2基因的MD17在CSBV感染中的功能研究結(jié)果顯示,MD17可以在293T細胞中抑制CSBV VP2基因的表達,且經(jīng)流式細胞儀檢測干擾效果接近40%,而飼喂MD17后的幼蟲體內(nèi)CSBV拷貝數(shù)在各時間點均低于CSBV感染組,同時幼蟲存活率也明顯上升,與CSBV感染組相比差異極顯著(P0.01),表明通過干擾MD17的產(chǎn)生,能夠影響CSBV在中華蜜蜂幼蟲體內(nèi)的復制。結(jié)論1、共鑒定出151個已知宿主mi RNA和2個宿主新mi RNA,并且發(fā)現(xiàn)中華蜜蜂幼蟲在感染CSBV后,宿主mi RNA的靶基因主要參與調(diào)控代謝途徑、胞吞作用以及m RNA的降解。2、預測到146,960個病毒vi RNA,6個潛在的vmi RNA,并且靶向病毒的vi RNA基因主要與病毒感染相關,而靶向宿主的vi RNA基因主要參與了宿主的代謝途徑,其次還有少量的靶基因參與了宿主的胞吞作用以及RNA降解。同時在感染CSBV的幼蟲體內(nèi)檢測到6條病毒vmi RNA前體,并通過測序結(jié)果證明了它們均源自CSBV。3、針對MD17設計si RNA進行RNAi干擾,能夠抑制CSBV在中華蜜蜂幼蟲體內(nèi)的復制,推測MD17可能在機體防御CSBV感染過程中發(fā)揮著重要作用。
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S895
【圖文】：

為 Dicer 酶切割的結(jié)果，siRNA 集中在 24 nt，piRNA 集RNA 與參考序列比對分析及其分類注釋owtie 將 sRNA 與蜜蜂和 CSBV 基因組進行比對，分析其分布，為了了解感染和未感染 CSBV 幼蟲中 sRNA 的種類s 與各類 RNA 比對，按照 known miRNA > rRNA > tRNArepeat > > novel miRNA 的優(yōu)先級順序進行分類注釋。通 virus 的讀數(shù)，即若 read 序列長度的 50%位于成熟體位置s 的 reads，或初步的 reads 屬于蜜蜂參考基因組的非比對里的 other 中的 reads 則保留為最終的鑒定的 virus 的 rea

表 1 RNA 文庫數(shù)據(jù)過濾表類型 L_H L_ITotal reads 15,366,167 (100.00%) 19,186,693 (100.00%)N% > 10% 634 (0.00%) 0 (0.00%)low quality 3846 (0.03%) 8,594 (0.04%)5 adapter contamine 5210 (0.03%) 10,849 (0.06%)3 adapter null or insert null 332,614 (2.16%) 453,481 (2.36%)with ployA/T/G/C 90,160 (0.59%) 27,293 (0.14%)clean reads 14,933,703 (97.19%) 18,687,476 (97.40%)

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