【摘要】：禾谷縊管蚜Rhopalosiphum padi(L.)屬于半翅目Hemiptera、蚜科Aphididae,是重要的小麥害蟲之一,在我國及世界各小麥種植區(qū)均廣泛分布。該蟲不但直接刺吸危害小麥,而且傳播大麥黃矮病毒,每年給小麥生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟損失。禾谷縊管蚜的防治主要依靠化學(xué)防治,而殺蟲劑的不合理使用已經(jīng)導(dǎo)致該蟲對多種不同類型殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性。細(xì)胞色素P450酶系和羧酸酯酶酶系是昆蟲體內(nèi)兩類關(guān)鍵解毒酶系,在昆蟲對殺蟲劑的解毒代謝過程中起著重要作用。目前,細(xì)胞色素P450和羧酸酯酶介導(dǎo)的禾谷縊管蚜抗性機制鮮有報道。本研究利用禾谷縊管蚜基因組數(shù)據(jù),系統(tǒng)解析禾谷縊管蚜P450基因的序列信息,研究P450基因在異丙威抗性品系中的表達(dá)變化和應(yīng)對異丙威刺激的響應(yīng);運用RNAi研究抗性相關(guān)的P450基因在異丙威等殺蟲劑抗性中的作用;克隆獲得CYP6CY3-3這一新的CYP6CY3基因簇基因,分析禾谷縊管蚜吡蟲啉抗性品系和敏感品系間CYP6CY3-3基因表達(dá)差異,并從轉(zhuǎn)錄水平上探討CYP6CY3-3基因表達(dá)的調(diào)控機制;首次克隆獲得禾谷縊管蚜細(xì)胞色素P450還原酶基因序列,分析RpCPR與該蟲對異丙威和吡蟲啉抗性的關(guān)系,檢測RpCPR在禾谷縊管蚜田間個體中的多態(tài)性;研究羧酸酯酶在禾谷縊管蚜對異丙威和氯氟氰菊酯抗性中的作用。本研究結(jié)果對于系統(tǒng)分析禾谷縊管蚜代謝抗性機理具有重要意義,并對制定該蟲的抗性治理與綜合防治策略具有重要的指導(dǎo)意義。主要研究結(jié)果如下:一、禾谷縊管蚜P450基因的鑒定、克隆及其在異丙威抗性中的作用利用公共數(shù)據(jù)庫中的禾谷縊管蚜基因組數(shù)據(jù),根據(jù)序列注釋和P450保守結(jié)構(gòu)分析,獲取初始禾谷縊管蚜P450基因序列信息;然后通過序列多重比較和手工注釋,共鑒定禾谷縊管蚜P450基因54條。這54條P450基因分布于4個集團9個家族17個亞家族中,其中CYP2、CYP3、CYP4和mitochondrial集團分別有9個、24個、15個和6個P450基因。經(jīng)RT-PCR成功擴增了50個P450基因,Rpa00969和Rpa18866經(jīng)多對引物PCR擴增均未獲得,Rpa00968、Rpa16802和Rpa16803測序結(jié)果表明為同一P450基因。生物測定結(jié)果顯示本實驗室建立的禾谷縊管蚜異丙威抗性品系(IS-R)相對于敏感品系(SS)對異丙威產(chǎn)生32.4倍抗性,IS-R品系對氨基甲酸酯類殺蟲劑滅多威、克百威和茚蟲威分別產(chǎn)生12.56倍、8.74倍和6.07倍的交互抗性。P450酶活力測定表明抗性品系中P450酶活是敏感品系中的1.78倍,表明P450在禾谷縊管蚜異丙威抗性中起著重要作用。通過qPCR分析CYP3和CYP4集團P450基因在抗異丙威品系和敏感品系中的表達(dá)差異,結(jié)果表明CYP6CY7、CYP6CZ1和CYP4CJ1三個P450基因表達(dá)差異顯著。進(jìn)一步探究上述三個P450基因?qū)Ξ惐幚淼捻憫?yīng),利用LC_(25)、LC_(50)和LC_(75)濃度的異丙威分別對抗性品系和敏感品系進(jìn)行處理。qPCR結(jié)果顯示在不同濃度的異丙威處理無翅成蚜24 h后,CYP4CJ1基因在禾谷縊管蚜敏感品系和抗異丙威品系中均顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。通過注射dsCYP4CJ1干擾該基因表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP4CJ1基因在注射dsRNA48 h后的表達(dá)量下降36.33%;利用LC_(50)濃度的異丙威、滅多威、克百威和茚蟲威分別處理禾谷縊管蚜,與注射dsGFP的對照組相比,注射dsCYP4CJ1 24 h后各農(nóng)藥處理組的死亡率分別提高34.12%、23.05%、26.87%和30.58%,表明該基因參與禾谷縊管蚜對異丙威的抗性。二、禾谷縊管蚜P450 CYP6CY3-3基因的克隆和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究克隆獲得新的禾谷縊管蚜CYP6CY3-3基因,氨基酸序列分析顯示,CYP6CY3-3與本研究組之前報道的CYP6CY3-1和CYP6CY3-2共同組成了禾谷縊管蚜CYP6CY3基因簇。qPCR結(jié)果顯示禾谷縊管蚜吡蟲啉抗性品系中CYP6CY3-3基因在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上調(diào)表達(dá)。為分析CYP6CY3-3在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機制,以禾谷縊管蚜敏感品系(SS)和吡蟲啉抗性品系(IM-R)基因組DNA為模板,通過基因組步移技術(shù)獲得CYP6CY3-3基因的5′側(cè)翼區(qū)序列。對兩個品系的單個個體進(jìn)行測序分析,發(fā)現(xiàn)IM-R品系的CYP6CY3-3基因的5′側(cè)翼區(qū)序列多樣性顯著低于SS品系。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)5′側(cè)翼區(qū)存在多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)對CYP6CY3-3 5′端不同區(qū)段進(jìn)行啟動子活性分析,發(fā)現(xiàn)-1044/-757區(qū)段在調(diào)控CYP6CY3-3基因表達(dá)方面起著重要作用。三、禾谷縊管蚜NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶基因克隆、抗性品系中的表達(dá)模式和田間種群多態(tài)性研究NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶(CPR)是所有微粒體型P450基因唯一電子傳遞者,在P450代謝活力調(diào)控中起重要作用。本研究通過RACE技術(shù)成功克隆禾谷縊管蚜CPR基因(RpCPR),氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)RpCPR含有FMN、FAD及NADPH保守功能區(qū)域,與豌豆蚜CPR基因的親緣關(guān)系最近。RpCPR基因在禾谷縊管蚜不同發(fā)育階段表達(dá)水平不同,在2齡若蟲中表達(dá)量最高,在成蟲中表達(dá)水平最低。RpCPR基因在IS-R和IM-R品系中表達(dá)量分別為敏感品系SS中表達(dá)量的3.74和3.52倍。利用LC_(30)濃度的異丙威和吡蟲啉分別處理禾谷縊管蚜敏感品系,在LC_(30)異丙威誘導(dǎo)下,RpCPR轉(zhuǎn)錄本上調(diào)表達(dá)1.66-2.18倍;在LC_(30)吡蟲啉誘導(dǎo)下,RpCPR基因表達(dá)量于3 h上調(diào)至1.85倍,在6 h達(dá)到2.08倍,在12 h和24 h分別為對照的1.16倍和1.19倍。RpCPR與禾谷縊管蚜對吡蟲啉和異丙威的抗性存在相關(guān)性。對采自我國11個地區(qū)的禾谷縊管蚜地理種群的167個個體的RpCPR序列進(jìn)行克隆測序分析,這些個體的RpCPR基因共存在334個核苷酸多態(tài)位點,共146個單倍型。其中65個多態(tài)位點在2個以上個體中被檢測到,A627T、G1362A、C1450T和A1536T四個核苷酸多態(tài)位點在31.7%、35.3%、35.3%和30.5%的個體中被發(fā)現(xiàn)。RpCPR的氨基酸序列存在194個錯義突變位點,其中21個突變位點為簡約性信息位點,P484S位點在11個地理種群共59個個體中發(fā)現(xiàn)。四、羧酸酯酶在禾谷縊管蚜抗異丙威和氯氟氰菊酯中的作用酶活分析顯示禾谷縊管蚜抗異丙威品系(IS-R)和抗氯氟氰菊酯品系(CY-R)的羧酸酯酶活性顯著上調(diào),分別為敏感品系(SS)的2.20倍和2.05倍,表明禾谷縊管蚜羧酸酯酶與異丙威和氯氟氰菊酯抗性相關(guān)。利用本課題組已有的禾谷縊管蚜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得7個禾谷縊管蚜羧酸酯酶基因。qPCR結(jié)果顯示CL2102基因在IS-R和CY-R中的表達(dá)量均顯著上調(diào),分別為SS的4.99倍和2.73倍,因此進(jìn)一步對CL2012基因進(jìn)行深入分析。通過RACE技術(shù)克隆獲得CL2012 cDNA全長序列,命名為RpCarE(GenBank登錄號:MH561903)。同源進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)RpCarE在氨基酸水平上與桃蚜酯酶FE4、豌豆蚜酯酶FE4、大豆蚜羧酸酯酶和棉蚜羧酸酯酶存在較高的相似性。序列分析表明RpCarE保留羧酸酯酶典型催化三聯(lián)體(S185-H432-E312)。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對RpCarE進(jìn)行原核表達(dá),以獲得體外重組蛋白并進(jìn)行功能研究。純化的RpCarE蛋白對模式底物α-NA具有較強的親和力,能很好地結(jié)合底物,K_(cat)/K_m為0.13μM~(-1)·s~(-1),表明經(jīng)由原核表達(dá)系統(tǒng)獲到的RpCarE純化蛋白為具有水解活性的羧酸酯酶。利用HPLC測定RpCarE重組蛋白對異丙威和氯氟氰菊酯兩種農(nóng)藥的水解活性,發(fā)現(xiàn)該蛋白對兩種農(nóng)藥均有顯著代謝活性。利用SYBYL X2.0軟件完成RpCarE與異丙威和氯氟氰菊酯對接模型,分子對接結(jié)果顯示異丙威和氯氟氰菊酯農(nóng)藥分子可以很好地定位于RpCarE的活性口袋,并與催化三聯(lián)體(S185-H432-E312)緊密相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S435.122.2
【圖文】：

圖 1-1 行為變化和生理差異介導(dǎo)的昆蟲抗藥性示意圖（以臭蟲對擬除蟲菊酯的抗性為例）a：敏感個體，b：抗性個體（Dang et al.，2017）。Fig. 1-1 Schematic of potential behavioral and physiological changes involved in insecticide resistance inbed bugs. a, susceptible bed bug. b, resistant bed bug (Dang et al., 2017).1.2.1 行為抗性行為抗性（Behavioral resistance）是指昆蟲通過主動回避、減少與農(nóng)藥接觸，例如通過拒食、逃避來避免接觸藥劑，從而能夠存活于對大多數(shù)普通個體致死的農(nóng)藥環(huán)境中的任何行為（陶士強等，2005）。行為改變可歸納為依懶性的行為回避和非依懶性的行為回避兩種（張凡，2011；周小潔和曾曉們，2014；Zalucki and Furlong，2017）。依懶性的行為回避是指昆蟲在受到直接刺激后表現(xiàn)的回避；而非依懶性的行為回避是指群體中部分昆蟲對某種環(huán)境或寄主具有天然的回避性。德國小蠊 Blattella germanica 對滯留噴灑過殺蟲劑的物體表面表現(xiàn)出行為上的回避性，Wang et al.（2004）在美國辛辛那提州發(fā)現(xiàn)德國小蠊 Cincy 品系對阿維菌素和氟蟲腈的毒餌產(chǎn)生了明顯的行為抗性。玉米象 Sitophilus zeamais 在溴氰菊酯的刺激下，其抗性品系和敏感品系在行為抗性上表現(xiàn)出明顯差異（Guedes et al.，2009）。Fray et al（.2014）發(fā)現(xiàn)，桃蚜 Myzus persicae FRC

1-2 細(xì)胞色素 P450 系統(tǒng)發(fā)育樹（Feyereisen，2006）。 insect P450 genes and their relationship to vertebrate CY2006).50 的結(jié)構(gòu)特征因家族成員在核苷酸和氨基酸序列上具有較高在空間結(jié)構(gòu)上卻存在較高的相似性。多物種大 最保守的氨基酸序列為與血紅素配體結(jié)合的半xCxG）是細(xì)胞色素 P450 最保守的結(jié)構(gòu)域，常征；此外，昆蟲 P450 還存在四個比較保守的列，位于螺旋 I 的 xGxxT 序列，位于螺旋 KxF 序列（圖 1-3）。量 P450 氨基酸序列分析比對，Gotoh（1992）提nition sites，SRS）的概念，認(rèn)為 P450 存在六，SRS 對于不同 P450 和底物的結(jié)合非常關(guān)鍵（6）又增加幾個新的底物識別位點（SRS0、SRS2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳昌蘭;沈淑萍;程蘭;;小麥禾谷縊管蚜發(fā)生為害與生態(tài)環(huán)境研究[J];植物保護學(xué)報;1989年02期

2 程蘭;;氣候因素對禾谷縊管蚜發(fā)生程度的影響及預(yù)測[J];植物保護學(xué)報;1990年02期

3 周福才,陸自強,陳麗芳,徐勇惠,謝愷舟,昊劍;小麥品種對禾谷縊管蚜的抗性機理研究[J];江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報;1997年04期

4 李素娟,王興運,王經(jīng)倫,王志民;不同小麥品種對禾谷縊管蚜種群消長的影響[J];昆蟲知識;1995年02期

5 張成雙,何從召,鐘興友;禾谷縊管蚜的發(fā)生規(guī)律觀察及防治技術(shù)探討[J];植保技術(shù)與推廣;2002年05期

6 陳鈞林;禾谷縊管蚜生活習(xí)性的初步觀察[J];浙江林學(xué)院學(xué)報;1987年02期

7 周福才,陸自強,陳麗芳,祝樹德,李祥,徐勇惠;小麥形態(tài)特征與抗禾谷縊管蚜的關(guān)系[J];江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報;1998年04期

8 羅瑞梧，楊崇良，尚佑芬，李長松，趙玖華;禾谷縊管蚜越冬與遷飛的研究[J];華東昆蟲學(xué)報;1994年01期

9 王冬蘭,劉賢進(jìn),張存政,余向陽,顧正遠(yuǎn),李進(jìn);江蘇地區(qū)麥蚜對吡蟲啉敏感性監(jiān)測[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2003年06期

10 何富剛，王艷琴，顏范悅，張軍;禾谷縊管蚜在沈陽越冬簡報[J];遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué);1994年06期

相關(guān)會議論文 前3條

1 王剛;朱磊;張霞;白雪莉;張萍;;安陽市麥蚜發(fā)生規(guī)律研究[A];河南省植物保護研究進(jìn)展Ⅱ（上）[C];2007年

2 李素娟;張志勇;劉愛芝;武予清;李世功;程登法;何連生;田U

本文編號：2740593