【摘要】：馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是世界上重要的糧食作物,2015年馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的提出也表明它在我國占據(jù)越來越重要的地位。由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病對馬鈴薯生產(chǎn)的危害是最為嚴(yán)重的,而選育具有持久抗性的馬鈴薯品種是解決這個問題最經(jīng)濟(jì)環(huán)保的方法。因?yàn)椴≡嚓P(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)在不同病原菌中都很保守,而效應(yīng)子(effctor)進(jìn)化較快,因此PAMP誘導(dǎo)抗性(PAMP-triggered immunity,PTI)被認(rèn)為比效應(yīng)子誘導(dǎo)的抗性(effector triggered immunity,ETI)更加持久,但其抗性誘導(dǎo)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)本氏煙中的一個ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白K4CBY0對晚疫病菌分泌的一種PAMP INF1所誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死反應(yīng)是必需的。本課題旨在進(jìn)一步研究該蛋白對晚疫病抗性的功能及作用機(jī)制,為馬鈴薯晚疫病持久抗性育種提供理論及技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下:1.通過序列比對確認(rèn)候選ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白K4CBY0為NbGCN4(GENERAL CONTROL NONREPRESSIBLE 4)。構(gòu)建了NbGCN4的超量表達(dá)載體,分別在本氏煙上通過瞬時(shí)超量表達(dá)和VIGS沉默NbGCN4后結(jié)合晚疫病抗性鑒定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),超量表達(dá)NbGCN4使晚疫病抗性降低,而沉默NbGCN4后晚疫病抗性加強(qiáng),這暗示NbGCN4對晚疫病菌抗性的作用可能是負(fù)調(diào)控的。2.在本氏煙上通過VIGS沉默NbGCN4之后,在新生葉上瞬時(shí)超量表達(dá)誘導(dǎo)PTI反應(yīng)的基因Cf4/Avr4和NIP,以及誘導(dǎo)ETI反應(yīng)的基因R2/Avr2和R3a/Avr3a,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死反應(yīng)都受到了抑制,表明NbGCN4同時(shí)參與多種PTI和ETI免疫反應(yīng),可能是一個hub基因。此外,構(gòu)建了NbGCN4的干涉載體,通過遺傳轉(zhuǎn)化得到本氏煙干涉株系,經(jīng)過功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)有三個株系均不能識別INF1誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死反應(yīng),它們可以用于后續(xù)進(jìn)一步的晚疫病抗性機(jī)制研究。3.通過qRT-PCR分析StGCN4在經(jīng)過晚疫病菌14-2接種的馬鈴薯抗病材料09013、06HE13-1、08HE17H和感病材料93045、E-P-5的葉片中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)StGCN4在這五種材料中均能被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),且其表達(dá)量在抗感材料中沒有顯著性差異,暗示StGCN4可能參與植物的基礎(chǔ)免疫反應(yīng);通過qRT-PCR分析StGCN4在經(jīng)過不同的PAMPs包括CF、flg22、Pep13和chitin誘導(dǎo)的馬鈴薯品種E3葉片中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)StGCN4對CF的響應(yīng)最迅速,在0.5 h即顯著上調(diào)表達(dá),且在后期也一直持續(xù)上調(diào)表達(dá)。此外,StGCN4也能受到Pep13、flg22和chitin的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),但時(shí)間稍晚,一般在誘導(dǎo)1 h后,說明StGCN4可以響應(yīng)不同的PAMPs。另外還通過qRT-PCR分析StGCN4在經(jīng)過高鹽(100 mM NaCl)、高溫(35℃)、低溫(4℃)以及干旱等非生物脅迫處理的馬鈴薯材料AC142的葉片中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)StGCN4只有在干旱脅迫24h時(shí)有顯著上調(diào)表達(dá),而在其它誘導(dǎo)條件下表達(dá)量沒有顯著變化。以上結(jié)果暗示StGCN4可能主要參與生物脅迫的基礎(chǔ)防御。4.亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NbGCN4位于細(xì)胞膜上。CO-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NbGCN4不與Nb14-3-3互作,說明NbGCN4可能與擬南芥有不同的抗性機(jī)制;通過IP-MS進(jìn)一步篩選NbGCN4的互作蛋白,共鑒定到了22個候選蛋白,預(yù)測結(jié)果顯示其中有3個可能定位于細(xì)胞膜上,分別為一個具有LRR結(jié)構(gòu)域的類受體(A0A1S4A328)、一個RNA螺旋酶(A0A0V0IKF4)和一個包含DUF結(jié)構(gòu)域的蛋白(A0A2G2ZM45),它們最有可能與NbGCN4發(fā)生直接互作,但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S435.32
【圖文】：

圖 1：植物免疫的原則（Dodds and Rathjen 2010）Fig.1：The principles of plant immunity道 SGT1 是一類 hub 基因，SGT1 是 SKP1 的 G2 等位基因的抑制生物中高度保守，對 PTI 和 ETI 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)都起著必要o-Orozco et al 2017; Hoser et al 2014; Kadota et al 2010; Liu et al l 2002; Shirasu 2009）。當(dāng)參與 ETI 時(shí)，SGT1 介導(dǎo) R 蛋白，如 RPI-BLB220、RX123、R3A24、RPS425 和 MLA26，控制其穩(wěn)定性、平衡（Hoser et al 2014; Hoser et al 2013）。SGT1 通過與其他免疫相ACK1, Rac1, RAR1, HSP90 和 HSC70）相互作用，從而形成多蛋白 et al 2013; Kadota et al 2010; Nakashima et al 2008; Noel et al 2007; Sang et al 2008; Zhang et al 2015）。而 NbGCN4 在 PTI 和 ETI 的免疫信發(fā)揮功能還不清楚。

3.1 GCN4 氨基酸序列分析3.1.1ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 K4CBY0 為 NbGCN4本課題所研究的 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 K4CBY0 被注釋為 ABC transporter F familymember 4，在研究過程中發(fā)現(xiàn)有篇后來報(bào)道的蛋白 GCN4 也被同樣注釋（Kaundalet al 2017）。將 K4CBY0 的 ORF 序列用本氏煙的 cDNA 擴(kuò)增測序后與 NbGCN4的氨基酸序列利用Geneious 軟件進(jìn)行對比（圖 2），結(jié)果顯示 K4CBY0 與 NbGCN4的氨基酸序列只有 3 個氨基酸序列的差別，其余序列幾乎一致。和 NbGCN4 相比，K4CBY0 在第 53 位上多出一個 G，在第 89 位上由 E 變成 D，在第 668 位上由 T 變成 K，其余氨基酸序列全部相同，因此認(rèn)為 K4CBY0 就是 NbGCN4。三個氨基酸的差異可能是由于擴(kuò)增植物材料本氏煙的來源不同引起的。

【相似文獻(xiàn)】

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1 曉勤;;愛爾蘭人心目中的土豆[J];長江蔬菜;1988年04期

2 川合;貴雄;黃仁誅;;防止馬鈴薯腐爛[J];國外農(nóng)學(xué)-雜糧作物;1988年06期

3 灻河;徐大雅;林P徹

本文編號：2723129