【摘要】：家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)一種外形呈桿狀的細(xì)胞核DNA病毒,特異性地感染家蠶細(xì)胞(Bombyx mori Linnaeus)。病毒感染后,細(xì)胞中病毒蛋白在相對短的時間內(nèi)大量表達(dá),致使病毒蛋白來不及折疊而大量累積,從而誘發(fā)細(xì)胞的抗病毒防御反應(yīng)。自噬就是細(xì)胞的一種內(nèi)在抗病毒防御反應(yīng)。本研究以家蠶細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白BmGABARAP、BmLC3D及病毒多角體蛋白(polyhedrin)為對象,研究BmNPV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。主要結(jié)果如下:1.家蠶中自噬相關(guān)基因8(atg8)的進(jìn)化分析及分類以人類ATG8家族蛋白氨基酸序列為搜索序列,在NCBI已公布的273個昆蟲物種的部分基因組或全基因組序列中進(jìn)行BLASTP檢索,共檢索到208個蛋白序列。利用MEGA7.0軟件的MUSCLE法進(jìn)行多序列比對,GBLOCK軟件對不對稱序列及多變性序列進(jìn)行剪切,獲得相對保守序列,并用MEGA7.0最大似然算法構(gòu)建進(jìn)化樹。相對人類ATG8家族蛋白的GATE-16、GABARAP、LC3三個亞家族,昆蟲基因組不編碼GATE-16,故昆蟲ATG8家族蛋白分為2個亞家族:GABARAP亞家族和LC3亞家族。家蠶基因組編碼的兩個ATG8:BGIBMGA011783-TA和BGIBMGA010251-PA分別屬于GABARAP亞家族和LC3亞家族,并分別命名為BmGABARAP和BmLC3D。已有的文獻(xiàn)報道表明BmGABARAP是家蠶的一個自噬體標(biāo)記蛋白。本研究表達(dá)了BmLC3D N-端與eGFP的融合蛋白eGFP-LC3D,Western blot實驗發(fā)現(xiàn)了eGFP-LC3D的II條帶,但分子量只有約39.0 kDa;激光共聚焦掃描顯微鏡發(fā)現(xiàn)BmLC3D與BmGABARAP共定位于自噬體。這些結(jié)果表明BmLC3D是家蠶基因組編碼的另一個自噬體標(biāo)記蛋白。ATG8家族蛋白在ATG4切割加工后才能在自噬途徑中發(fā)揮作用。利用定點突變技術(shù)分別對BmGABARAP和BmLC3D的G116和G100進(jìn)行突變,Western blot檢測表明第G116和G100位甘氨酸分別為BmGABARAP和BmLC3D的ATG4切割位點。G100突變的BmLC3D在細(xì)胞中仍能形成斑點狀的自噬體。理論上講,BGIBMGA010251-PA含245個氨基酸(amino acid,aa)。根據(jù)BLASTP分析時對結(jié)構(gòu)域的預(yù)測,BGIBMGA010251-PA是一個前體蛋白,含有2個ATG8結(jié)構(gòu)域:(1).aa1-100,與eGFP融合后即為eGFP-LC3D;(2).aa 101-245。該序列被命名為cleaved LC3D(cLC3D)。根據(jù)以上實驗結(jié)果,推測cLC3D也是ATG8家族蛋白新成員。對此仍需進(jìn)一步驗證。2、BmNPV感染誘導(dǎo)自噬發(fā)生運用BmGABARAP的兔源多克隆抗體對BmNPV感染誘導(dǎo)的自噬進(jìn)行了研究。Western blot分析表明,培養(yǎng)基營養(yǎng)成分逐漸損耗(Medium nutrient depletion stress,MND-Stress)時,在32 h時即可檢測到微弱的BmGABARAP-II條帶,表明細(xì)胞培養(yǎng)過程中,隨著營養(yǎng)成分的消耗,細(xì)胞自噬緩慢增強;構(gòu)建BmGABARAP(或BmLC3D)與eGFP的融合表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后,發(fā)現(xiàn)BmGABARAP形成的自噬體成點狀結(jié)構(gòu),而BmLC3D的自噬體幾乎不存在。用BmNPV T3感染BmN細(xì)胞,在0 h p.i.即能檢測到BmGABARAP-II條帶,隨著BmNPV的持續(xù)感染,BmGABARAP-II的量持續(xù)增加,表明細(xì)胞自噬增強。用熒光顯微鏡可觀察到BmGABARAP及BmLC3D的自噬體,其形狀呈空腔狀,明顯區(qū)別于MND-Stress形成的自噬體;且含有自噬體的細(xì)胞百分比高于MND-Stress下的百分比。以上結(jié)果表明,BmNPV感染BmN細(xì)胞可誘導(dǎo)自噬。3.多角體蛋白參與細(xì)胞自噬的初步研究研究顯示,多角體蛋白和自噬標(biāo)記蛋白BmLC3D共定位于自噬體;Co-IP顯示二者有相互作用,表明多角體蛋白參與細(xì)胞自噬,且含有和ATG8相互作用的基序(ATG8 interaction motif,AIM)。利用定點突變技術(shù)對預(yù)測的多角體蛋白可能的AIM基序中關(guān)鍵氨基酸(W或F)進(jìn)行突變,Western blot分析表明多角體蛋白的~(47)WDLL~(50)氨基酸片段是多角體蛋白和BmGABARAP相互作用的基序(GABARAP interaction motif,GIM)。多角體蛋白與BmLC3D相互作用的AIM有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S884.51
【圖文】：

圖 1.1 29 種已知桿狀病毒的全基因進(jìn)化樹[6]1 Neighbour-joining tree of the amino acid alignment of 29 baculovirus cor構(gòu)建是基于 29 種桿狀病毒的核心基因的氨基酸序列及基因組序列構(gòu)建而大于 50%。輔助程序值大于 95%的在分支有標(biāo)注。ning tree of the amino acid alignment of 29 baculovirus core genes ofes. The alignment comprised 16349 positions. All branches have bootstrap vues >95% are given along the branches.用毒是已知昆蟲病毒的重要組成部分，隨著對桿狀病毒了解的深入桿狀病毒因其宿主特異性，基于此點研發(fā)的生物殺蟲劑，對于人很好的安全性。20 世紀(jì) 30 年代北美開始利用桿狀病毒成功防治蟲核型多角體病毒作為商品制劑的注冊成功都是對桿狀病毒作為桿狀病毒作為生物殺蟲劑相對于化學(xué)殺蟲劑還是存在殺蟲周期長

圖 1.3 自噬分類圖Figure 1 .3 Schematic representation of the different types of au生過程及分子機制生的顯著特征是形成自噬體，因此自噬發(fā)生過程通常需要經(jīng)環(huán)境及新陳代謝壓力下，mTOR 活性被抑制，ULK1 復(fù)合體位于吞噬泡膜上，自噬起始[24]。在兩個類泛素化系統(tǒng)的作用關(guān)基因（autophagy-related geneAtg）編碼的自噬相關(guān)蛋白 起著 E3 泛素連接酶的作用，幫助 E2 泛素結(jié)合酶 ATG3 酯化在自噬體膜的延伸過程中需要降解的蛋白或細(xì)胞器在自噬受隨著膜的延伸自噬體形成閉合環(huán)狀雙膜結(jié)構(gòu)[29]。緊接著自噬成自噬溶酶體，內(nèi)部貨物被降解成小分子物質(zhì)，繼續(xù)參與細(xì)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 前田進(jìn);張志芳;;家蠶重組BmNPV表達(dá)的昆蟲專一性神經(jīng)毒素的殺蟲效應(yīng)[J];國外農(nóng)學(xué)-蠶業(yè);1993年03期

本文編號：2723179