【摘要】：花生瘡痂病菌由落花生痂圓孢菌(Elsino?arachidis BitaucourtetJenkins)引起,是我國花生生產(chǎn)上的主要病害之一。該病常造成葉片皺縮,葉柄及莖部扭曲,減弱植株長勢引起減產(chǎn),一般病田減產(chǎn)10%-30%,嚴(yán)重時(shí)損失可達(dá)50%以上,嚴(yán)重制約了花生產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。該病害自上世紀(jì)90年代初在廣東暴發(fā)成災(zāi)后,相繼在廣西、福建、江蘇、山東、河北等主要花生產(chǎn)區(qū)發(fā)生流行,2010年在遼寧省興城首先發(fā)現(xiàn),2011年遼寧阜新、錦州及葫蘆島等花生主產(chǎn)區(qū)大面積流行成災(zāi),經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。花生瘡痂病研究基礎(chǔ)相對較為薄弱,對于病害的發(fā)生流行規(guī)律、病菌的傳播動態(tài)、群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)等尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本文以分離自遼寧、河北和山東花生主產(chǎn)區(qū)的瘡痂病菌為研究對象,系統(tǒng)開展了病原菌ISSR反應(yīng)體系建立、培養(yǎng)性狀和遺傳多樣性等研究工作,并通過遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳分化及發(fā)生時(shí)間歷程比較,初步分析了三個(gè)地區(qū)間的菌源關(guān)系,研究結(jié)果對于花生瘡痂病菌的傳播規(guī)律、流行動態(tài)及病原菌遷移等研究提供了理論研究基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.花生瘡痂病菌分離鑒定與培養(yǎng)性狀研究采集來自遼寧、河北、山東、江蘇、福建和廣西六省的花生瘡痂病標(biāo)本3000余份,采用優(yōu)化的組織分離技術(shù)得到519株花生瘡痂病菌菌株,本試驗(yàn)重點(diǎn)研究遼冀魯三省的375株,并結(jié)合培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和分子序列分析鑒定分離菌株均為花生瘡痂病菌。供試菌株具豐富的形態(tài)多樣性,病原菌生長緩慢,生長速度、形態(tài)、顏色及質(zhì)地差異顯著。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d時(shí)菌落直徑0.67-3.76cm,平均2.55cm(n=375)。菌落顏色分別有白色、黃白色、橙黃色、紅棕色、紅色等多種顏色,光照條件菌落周圍紅色或紅棕色暈圈明顯。菌落多為質(zhì)地柔軟、光滑、覆有絨毛狀氣生菌絲,且菌落形態(tài)多變不規(guī)則,中央隆起,邊緣呈波浪狀,少量呈圓形。2.花生瘡痂病菌ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化使用五因素四水平的正交設(shè)計(jì)與細(xì)調(diào)性單因素試驗(yàn)對花生瘡痂病菌PCR反應(yīng)主要成分的用量進(jìn)行系統(tǒng)研究,建立并優(yōu)化了最優(yōu)ISSR-PCR反應(yīng)體系。25μL的反應(yīng)體系中包括Mg~(2+)2.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1.5 U,引物0.88μmol/L,模板DNA30-40ng;篩選出的8條最適ISSR引物及退火溫度為UBC809(52.7℃)、UBC810(50.8℃)、UBC812(55.6℃)、UBC834(52.7℃)、UBC842(55.6℃)、UBC844(52.7℃)、UBC880(52.7℃)、UBC881(50.4℃);PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min,94℃變性1 min,退火1 min,72℃延伸1 min,35次循環(huán),72℃延伸10 min,4℃保存。該體系經(jīng)檢驗(yàn)的穩(wěn)定可靠,適用于花生瘡痂病菌的遺傳多樣性分析,為系統(tǒng)進(jìn)行花生瘡痂病菌群體遺傳研究奠定了基礎(chǔ)。3.遼冀魯花生瘡痂病菌遺傳多樣性研究采用優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系對遼寧(184株)、河北(135株)和山東(56株)花生瘡痂病菌進(jìn)行了遺傳多樣性研究,結(jié)果顯示遼寧省花生瘡痂病菌有較高的遺傳多樣性和中等遺傳分化,亞群體之間差異明顯,多態(tài)性位點(diǎn)比率為34.62%-75.64%,Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)范圍分別為0.14-0.25和0.20-0.37,亞群間遺傳分化系數(shù)θ范圍為0.087-0.347,呈中等遺傳分化。河北省和山東省的花生瘡痂病菌遺有分化程度較低,多態(tài)性位點(diǎn)比率分別為83.33%和66.67%,Nei’s遺傳多樣性指數(shù)均為0.21,Shannon信息指數(shù)分別為0.33和0.32,遺傳分化系數(shù)θ分別為0.025和0.061,基因流分別為20.39和10.35,均表明河北和山東群體遺傳分化不明顯。4.遼冀魯花生瘡痂病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)比較及菌源關(guān)系分析通過比較遼冀魯三省花生瘡痂病菌群體間遺傳結(jié)構(gòu)以及發(fā)生時(shí)間歷程,初步分析三省間種群菌源關(guān)系。群體間基因流和兩兩間比較分析顯示,群體間的基因流Nm均大于4(5.032-10.010),說明基因交流頻繁。AMOVA分析表明三省群體間存在一定的遺傳分化,但82%的變異來自亞群體內(nèi),10%的變異來自亞群體間,僅有8%的變異來自群體間。PCA主成分分析表明,三省菌株群體間交叉并存,山東省群體分布最集中,遼寧群體最分散,且山東與遼寧群體交叉重疊區(qū)域最大。Structure分析顯示三省群體可分為四個(gè)遺傳組,各組的比例在三省群體中分布不同,其中三個(gè)遺傳組為三省群體共享,一種為遼寧省獨(dú)有。三省病害發(fā)生歷程為山東2001年發(fā)生,河北2004-2010年逐漸加重,遼寧2010年于興城發(fā)生后,2011年起大范圍流行,表明了病原菌從山東到河北和遼寧的傳播方向。結(jié)合遺傳結(jié)構(gòu)和發(fā)生時(shí)間歷程可初步推斷三省病菌的菌源關(guān)系為:遼寧省群體可能部分來源于山東省和河北省群體,河北省群體可能部分來源于山東的群體。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.652
【圖文】：

圖 1-1. 漂變對不同大小種群中基因頻率的影響（Marginalia, 2009）Fig. 1-1. Effect of genetic drift on allele frequency of variable population size (Marginalia, 2009)在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，寄主植物的遺傳一致性往往使得植物病原真菌的群體很大，因此在某塊田間，遺傳漂變對病原菌演化力的影響可能微乎其微。但因農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的奠基者效應(yīng)的存在，我們不能忽略遺傳漂變的作用。在自然生態(tài)系統(tǒng)中，寄主植物不均勻的分布使得其病原真菌群體很小，這種情況下，遺傳漂變的作用就會十分明顯。2.2.3 基因流基因流（Gene flow）是特定等位基因或個(gè)體在不同地源種群間的交換過程。有些真菌只能通過無性繁殖方式來產(chǎn)生后代，在種群間的交換中不能進(jìn)行基因重組，交換的是整個(gè)基因型，這種交換的過程則稱作基因型流（Genotype flow）�；蛄鳟a(chǎn)生的條件有二：該物種至少存在一個(gè)以上的種群或亞群；不同的種群或亞群間的個(gè)體可自由移動(祝雯與詹家綏, 2012)。通過基因流，毒性突變基因和基因型可在不同地域的種群間進(jìn)行交換。較高的基因可以通過提高在遺傳上相鄰種群的大小來擴(kuò)大種群大小，因此具有高基因的種群往往會表現(xiàn)出較高水平的遺傳多樣性。銹菌和白粉菌產(chǎn)生的大量孢子可隨風(fēng)進(jìn)行可達(dá)數(shù)千公里

銹菌傳播路線 (Mcdonald and pathway in North America (Mcd在種群內(nèi)的個(gè)體間的如何分菌的生殖方式包括無性生減數(shù)分裂時(shí)進(jìn)行基因的重組生或組合新的毒性基因或抗綏, 2012)。而無性繁殖是許，無性孢子是致使病害流行性生殖階段，但其群體變異此基因型多樣性對其群體遺可使其發(fā)生遺傳重組，對群

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