【摘要】：赤星病是煙草上的主要病害之一,每年給我國煙草生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前,可用于赤星病防治的方法較多,其中最具有應(yīng)用前景與發(fā)展?jié)摿Φ漠?dāng)屬生物防治。煙草根際土壤和煙葉葉圍等處包含有大量的微生物資源,其中部分微生物因其具有可以抑制病原微生物、促進煙草生長和誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得性抗性的表達等特性,所以在生產(chǎn)上被廣泛應(yīng)用于病蟲害的生物防治。本文從煙草根際土壤中分離出82株細菌,通過平板對峙法初步篩選和雙層平板法復(fù)篩,篩選出對煙草赤星病菌有較強拮抗作用的細菌F11菌株,其無菌發(fā)酵液對煙草赤星病菌(Alternaria alternata)的抑菌帶達到23.5 mm。對F11菌株進生理生化和分子鑒定,結(jié)果表明F11菌株生理生化特征與Bacillus methylotrophicus最為接近,其16S r RNA基因序列與芽孢桿菌屬(Bacillus)有99%的同源性。加測F11菌株的gyr A基因,發(fā)現(xiàn)F11的gyr A基因序列與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus Y37菌株的gyr A基因序列同源性達99%。鑒定該菌株為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)。從5種常用細菌培養(yǎng)基中篩選最佳培養(yǎng)基。使用Design-Expert軟件,采用響應(yīng)面法尋找最優(yōu)發(fā)酵條件。最佳培養(yǎng)基為PDB,最佳培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度35℃、初始p H 7.5、接種量3%、發(fā)酵時間36 h、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、瓶裝量100m L/250m L。在此優(yōu)化條件下,發(fā)酵液抑菌帶可達26.8 mm,比優(yōu)化前(20.3mm)提高了32%。此菌株抑菌活性強,具有開發(fā)成生防劑的潛力;為煙草赤星病的防治機理的研究提供一定的參考依據(jù)。通過生防菌的生防機制初步研究表明:(1)F11菌株發(fā)酵上清液對煙草赤星病菌絲形態(tài)有明顯的影響作用,主要表現(xiàn)出頂端膨大、菌絲畸形成結(jié)節(jié)狀,原生質(zhì)明顯聚集,菌絲呈念珠狀膨大,細胞破裂,細胞質(zhì)外滲。(2)不同濃度F11發(fā)酵上清液均能抑制赤星病菌孢子的萌發(fā),不同時間的抑制率均隨著發(fā)酵上清液濃度的增加而增加。經(jīng)不同濃度處理的赤星病孢子表現(xiàn)為大部分液泡化并破裂,細胞質(zhì)外滲,畸形萌發(fā),且萌發(fā)部位出現(xiàn)膨大、圓泡狀物等現(xiàn)象,不能發(fā)育成正常菌絲。(3)用F11菌株發(fā)酵上清液處理菌絲后,菌絲內(nèi)電解質(zhì)滲漏發(fā)生嚴重,處理的電導(dǎo)率均高于對照。(4)經(jīng)F11菌株發(fā)酵上清液處理的煙草赤星病菌菌絲體內(nèi)的內(nèi)含物(可溶性糖和可溶性蛋白)大量外滲,總糖和可溶性蛋白質(zhì)含量均低于對照組,會導(dǎo)致菌絲體內(nèi)自身總糖和可溶性蛋白含量減少。(5)煙草赤星病菌菌絲體在經(jīng)F11發(fā)酵上清液處理后,其蘋果酸脫氫酶(MDH)和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性均會降低,導(dǎo)致菌絲體細胞生長緩慢或停滯。在前期研究基礎(chǔ)上,選用10%苯醚甲環(huán)唑、40%菌核凈、10%多抗霉素,以及F11菌株發(fā)酵上清液和F11菌株活菌液進行田間防效試驗。結(jié)果表明:3種藥劑處理和2種菌劑對煙草赤星病均有一定的防治作用。其中防效最好的是10%多抗霉素,相對防效為63.14%;其次是40%菌核凈,相對防效為58.71%;10%苯醚甲環(huán)唑的相對防效為49.71%;F11菌株發(fā)酵上清液和活菌液也有一定的作用,防效分別為41.43%和49.86%。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S476;S435.72
【圖文】：

到碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基20 mL中后滅菌。取10 uL濃度為108cfu/mL的F1培養(yǎng)基內(nèi)試管內(nèi)，于35℃下振蕩(150 rpm)培養(yǎng)，以不接菌的培養(yǎng)察并在625 nm處測定菌體的吸光度并記錄結(jié)果。 氮源對 F11 生長的影響源種類為蛋白胨、草酸銨、牛肉膏、酵母浸膏和尿素等，以 1%的源基礎(chǔ)培養(yǎng)基 20 mL 中后滅菌。取 10 uL 濃度為 108cfu/mL 的 F1培養(yǎng)基內(nèi)，于 35℃下振蕩(150 rpm)培養(yǎng)，以不接菌的培養(yǎng)基為 并在 625 nm 處測定菌體的吸光度并記錄結(jié)果。與分析防菌的篩選過平板對峙法初步篩選出 4 株對煙草赤星病菌生長有抑制作用的見圖 1.1)，再用雙層平板法進行復(fù)篩，比較 4 株菌株對病原菌生長菌效果見圖 1.2)。

圖 1.2 煙草赤星病生防菌復(fù)篩結(jié)果Fig. 1.2 The results of screening of tobacco brown spot disease-resistant bacteria表 1-1 表明，經(jīng)復(fù)篩，4 株菌株對病原菌生長均有明顯的抑制作用，其中 菌株的抑菌活性最強。對病原菌的抑菌帶為 23.5 mm，4 株生防菌的抑菌效果實驗對照組差異性顯著，其中 F11 抑菌效果差異顯著型最強。表 1-1 4 株生防菌對煙草赤星病原菌的抑制效果及抑菌效果差異顯著性分析Table 1-1 Inhibitory effect of four antagonistic bacteria on Alternaria alternata and significant differeanalysis of antibacterial effect菌株編號Strain number抑菌帶Inhibition zone (mm)① ② ③ 平均F11 23.5 23.8 23.2 23.B2 16.5 16.0 14.6 15.F10 14.9 15.0 15.0 15.

【參考文獻】

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本文編號：2721384