【摘要】：柑橘潰瘍病是一種由地毯黃單胞菌柑橘致病變種(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)所引起的檢疫性細(xì)菌病害,給世界柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大損失,目前還沒有有效防治方法,培育抗病品種是解決柑橘潰瘍病危害的根本途徑�？共』蛸Y源發(fā)掘是抗病育種的基礎(chǔ),因此,本實驗集合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和柑橘BZIP基因家族生物信息學(xué)分析,篩選到可能與柑橘抗?jié)儾∠嚓P(guān)的候選基因CsBZIP40,并開展誘導(dǎo)表達(dá)分析、轉(zhuǎn)基因功能驗證,結(jié)果表明CsBZIP40是響應(yīng)潰瘍病菌侵染的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子,可為進(jìn)一步抗病分子育種研究提供理論依據(jù)及抗病基因資源。本實驗研究對象是在本課題組前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上篩選到CsBZIP40。為確定CsBZIP40基因功能研究的可行性,首先利用柑橘全基因組公共數(shù)據(jù)庫,對柑橘BZIP轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行綜合專業(yè)注釋以獲得柑橘中BZIP家族的所有成員信息,并根據(jù)其染色體位置對其進(jìn)行命名;利用MEME分析其結(jié)構(gòu)域;利用MEGA6.0分析柑橘與擬南芥BZIP的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,并且根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系對該基因家族進(jìn)行分類,確定CsBZIP40在擬南芥中同源基因的研究進(jìn)展及功能。經(jīng)過一系列的實驗,我們從柑橘全基因組數(shù)據(jù)庫中注釋到47個BZIP轉(zhuǎn)錄因子,經(jīng)BZIP家族染色體定位、結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示CsBZIP40基因與擬南芥中AT1g08320同源基因,屬于柑橘10個亞家族中參與病菌防御的D亞類,且AT1g08320與ROS介導(dǎo)的病原防御途徑相關(guān),為該基因功能研究提供理論支撐。隨后,克隆CsBZIP40基因及其啟動子,并進(jìn)行基因序列和啟動子元件分析。分析結(jié)果表明該基因序列全長5756 bp,開放閱讀框長度為1530 bp,一共編碼氨基酸509個,啟動子元件含多個與植物逆境或激素應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件,例如Box-W1、HSE、ERE等。CsBZIP40含有核定位信號,通過構(gòu)建GFP融合表達(dá)載體,并利用洋蔥表皮亞細(xì)胞定位分析;實驗證明此蛋白在細(xì)胞核內(nèi)優(yōu)勢表達(dá),具備轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的前提。為了確定CsBZIP40的誘導(dǎo)表達(dá)模式,利用qRT-PCR方法分析感染潰瘍病菌(Xcc)、水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利(ET)以及機械損傷(Wounding)對該轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)表達(dá)。柑橘潰瘍病菌侵染誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果表明,抗病品種四季橘中此基因上調(diào)表達(dá),而在感病品種紐荷爾臍橙中該基因?qū)Ω涕贊儾【秩緵]有響應(yīng),表明潰瘍病菌誘導(dǎo)后,在紐荷爾臍橙和四季橘中CsBZIP40的表達(dá)存在差異性。本實驗經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)外源水楊酸(SA)可使抗病品種四季橘CsBZIP40的表達(dá)水平顯著上調(diào),感病品種紐荷爾臍橙中CsBZIP40的表達(dá)水平先升后降;在茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)后感病紐荷爾中CsBZIP40有明顯上調(diào)差異表達(dá),抗病品種四季橘中CsBZIP40的表達(dá)水平下降,表明CsBZIP40可能是通過SA調(diào)控途徑影響柑橘的品種抗性。為進(jìn)一步確定CsBZIP40對柑橘潰瘍病的影響,從而分析此轉(zhuǎn)錄因子與柑橘潰瘍病抗、感的關(guān)系。通過構(gòu)建CsBZIP40的超表達(dá)載體和干擾表達(dá)載體,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化柑橘,我們共獲得5株超表達(dá)CsBZIP40和11株干擾抑制表達(dá)CsBZIP40的轉(zhuǎn)基因植株。利用離體接種潰瘍病菌法,對轉(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)行抗性評價,超表達(dá)CsBZIP40的轉(zhuǎn)基因植株可以明顯降低柑橘潰瘍病的病斑面積和病情指數(shù),而干擾抑制表達(dá)CsBZIP40的轉(zhuǎn)基因植株可以顯著增加柑橘潰瘍病斑的面積及病情指數(shù)。實驗結(jié)果表明CsBZIP40是響應(yīng)潰瘍病菌侵染的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子,可能通過SA調(diào)節(jié)途徑影響柑橘抗性,CsBZIP40的表達(dá)水平與柑橘潰瘍病的抗性呈正相關(guān)關(guān)系,可以作為柑橘抗?jié)儾》肿佑N的一個重要候選基因,具有較大的應(yīng)用價值。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.66
【圖文】：

圖 1. 橙汁產(chǎn)量與需求量的變化。Fig 1. The production of Citrus sinensis in resent years.注：數(shù)據(jù)來源：美國農(nóng)業(yè)部。Note: data source: United States Department of Agriculture (USDA)..1.3 柑橘營養(yǎng)價值及市場需求對柑橘果實而言，水是基本成分，其果肉含水量為 85 % - 90 %，有機物約 15 %。有主要是蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖類、類黃酮、類胡蘿卜素檸檬堿等小分子化合物。就不同、品種來說，種間差異較大[11]。近年來，柑橘因其本身的食用和藥用價值及衍生出來的使用價值而飽受追捧。目前，已從柑橘中分離出 30 余種對人體起保健作用的成分，主要有：類黃酮、類胡蘿卜素、素、類丙醇、甘油糖脂質(zhì)等。柑橘中的香豆素是已被充分肯定的抗癌物質(zhì)檸檬苦素對腫形成與發(fā)展具有抑制作用；維生素 C 是強氧化劑，可以使機體免于自由基的威脅。此皮、橘絡(luò)、橘根、橘葉可以作為中藥材入藥，具通絡(luò)、止痛、健脾等功效[12]。

OsTGA10 突變株可引起雄蕊不育，但在雄蕊發(fā)育過程中優(yōu)勢表達(dá)，而且該基因也是絨形成所必需的基因，由此可見某些 E 類亞家族成員在植物器官發(fā)育過程中也發(fā)揮作用[95然，BZIP 轉(zhuǎn)錄因子在與植株病害及其他信號途徑方面也有相關(guān)研究，例如，番茄中eBZIP3 和 MeBZIP 受病原菌識別因子 flg22、 SA 信號途徑及過氧化劑 H2O2 的調(diào)控表達(dá) MeBZIP3 和 MeBZIP5 的轉(zhuǎn)基因植株可以提高番茄對萎疫�。�(xì)菌性病害）的抗性由 VIGS 沉默表達(dá)系統(tǒng)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株更易感��；而番茄中的 SIBZIP 可以負(fù)調(diào)控 A號途徑，對干旱和鹽脅迫引起的防衛(wèi)反應(yīng)有抑制作用[96]。擬南芥中的 TGA9 和 TGA10與 ROXY1、 ROXY2 發(fā)生互作，在擬南芥開花和其他生理發(fā)育此過程中發(fā)揮作用，另除 TGA10 的突變株對 flg22 敏感，敲除 TGA9 的突變株對 flg22 不敏感，而 TGA9GA10 雙敲除的突變體對 flg22 更敏感，另外， flg22 可以誘導(dǎo)這兩個轉(zhuǎn)錄因子在葉片中達(dá)，參與葉綠體基質(zhì)和類囊體中抗壞血酸過氧化物酶引起的防衛(wèi)反應(yīng)[97]�？傮w來看，植ZIP 轉(zhuǎn)錄因子在病害方面的研究應(yīng)集中在 D 類 BZIP 成員，但該亞家族在柑橘潰瘍病方作用還鮮有研究，因此，本實驗以柑橘為材料針對 BZIP 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因功能研究，步探索 CsBZIP40 對柑橘潰瘍病的影響，分析其在柑橘抗病育種中的價值，具有一定的意義。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2715803